2018—2020年度乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品的研制及其应用

目的 制备乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,并应用于2018—2020年度实验室能力验证考核。方法 将背景菌株和克罗诺杆菌属通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备的阴性样品(含背景菌)和阳性样品(含背景菌和克罗诺杆菌属)。随机抽取阳性样品和阴性样品各20份进行均匀性检验,然后将样品分别存放于-20℃和4℃进行储藏稳定性检验,存放于25℃和37℃进行运输稳定性检验。向参加考核的实验室发放样品并提供作业指导书,回收各实验室结果进行统计。结果 菌株种属鉴定结果与预期结果一致,均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均满足要求。2018—2020年度考核结果满意率分别为97.1%、94.7%和100%。结论 制备的样品满足此能力验证项目的需求,通过组织能力验证考核可以反映出我国实验室之间差异,有助于进一步提高实验室检验水平。     

食品中副溶血性弧菌检验能力验证样品的研制及其应用

目的研制食品中副溶血性弧菌检验能力验证样品,并应用于副溶血性弧菌能力验证试验中。方法能力验证样品包括0～3瓶阳性样品和0～3瓶阴性样品。阴性样品仅含有背景细菌,阳性样本在背景菌的基础上添加有副溶血性弧菌。为防止数据串通,编制1～180的随机数字表,其中90个随机数字作为阳性样品编码,另外90个随机数字则用为阴性样品编码。随机抽取冻干质控阳性样品、阴性样品各20瓶,参照本次能力验证推荐的GB4789.7-2013对样品进行均匀性检验,阳性样品均需要检出副溶血性弧菌,而阴性对照样品应不得检出副溶血性弧菌。将副溶血性弧菌能力验证样品分别在?30、4℃储藏30d监测其储藏稳定性,同时在25和37℃下储藏7 d监测其运输稳定性。结果副溶血性弧菌的质控样在均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均能满足质控样使用的要求。在39家实验室反馈结果中,36家结果评定为满意,满意率为92.3%。结论食品中副溶血性弧菌能力验证样品可以满足此次能力验证的需求,国内实验室大部分能满足考核要求,仍有部分实验室需要提高检验检测能力。     

食品检测用副溶血性弧菌标准物质的制备和评价

该研究制备并检测了不含基质的副溶血性弧菌标准物质。用质谱、生化、16S RNA基因序列测定3种方法对菌株CMCC20030分别确认种属。先采用冷冻干燥技术制备800个样品[103 CFU/样品(20 μL)]。然后随机抽取20个样品进行均匀性检验;再将样品存放25、37 ℃分别在1、3、5、7 d取出进行运输稳定性检验,将样品存放4 ℃分别于7、14、28 d进行短期保藏性检验,将样品存放-20 ℃分别于14、28、60 d的保藏稳定性检验。组织5家实验室对样品进行协同标定。最后用食品基质检测使用效果。菌株CMCC20030经3种方法均鉴定为副溶血性弧菌。均匀性检验中,F样品=1.930,小于FINV（0.05,19,20）。稳定性检验中,于-20 ℃保藏60 d、4 ℃保存28 d、25 ℃保藏7 d和37 ℃保藏3 d后,活菌含量103 CFU/样品。协同标定实验中,5家实验室结果均为103 CFU/样品。使用效果实验中,20种食品基质加入样品后均可以检出,本底对照均未检出。制备的不含基质的副溶血性弧菌样品满足标准物质要求,可依据不同目的灵活使用。     

乳粉中沙门氏菌能力验证样品研制及应用评价

目的 研制均一性和稳定性符合能力验证要求的沙门氏菌能力验证样品,并应用于乳粉中沙门氏菌检测的能力验证。方法 ： 选取本实验室保存的ATCC、CMCC标准菌株及食品中分离菌株作为能力验证样品的菌株来源,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和全自动微生物分析系统进行种属确认,并对沙门氏菌标准菌株进行血清学分型;采用冷冻干燥技术制备沙门氏菌能力验证样品,一套能力验证样品包括沙门氏菌阳性、阴性样品各1瓶以及灭菌的25g乳粉基质两份,阳性样本包含单一血清型的沙门氏菌、背景细菌和干扰菌,阴性样品仅含有背景细菌和干扰菌;采用冷冻干燥技术制备沙门氏菌能力验证样品,取阴性、阳性各20个能力验证样品添加灭菌乳粉基质后按照国标方法进行均匀性检验,并参照CNAS-GL003:2018,采用MPN法对能力验证样品进行沙门氏菌计数,评价其对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价,取阴性、阳性各20个能力验证样品添加灭菌乳粉基质后参照国标方法进行均匀性检验,并分别取3个样品于-20℃、4℃、25℃和37℃条件下保藏,添加灭菌乳粉基质后采用MPN法进行沙门氏菌计数;根据随机数字表对阴性、阳性样本进行编码,以防止机构实验室间数据串通。结果： 乳粉中沙门氏菌检测能力验证阳性样品于-20℃保藏12个月、4℃保藏7天 d后,沙门氏菌含量均仍能达到103以上;样品于25℃和37℃保藏7天后均能检出沙门氏菌,稳定性较好。17家实验室应用本样品进行了能力验证,报送结果与预期一致,的沙门氏菌分离鉴定结果评价均为满意,11家实验室报送了血清分型结果,其中9家合格。结论： 研制的沙门氏菌能力验证样品能够满足乳粉中沙门氏菌检测能力验证的需求,本次能力验证可以真实的反应参试单位实验室的检验能力。     

同时检测海产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法评价研究

目的建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,并对合检方法对比进行评价。方法利用副溶血弧菌和霍乱弧菌阳性菌株,制备纯菌液、不同浓度梯度的人工污染样品。通过对30份纯菌液、30份人工污染样品和250份实际样品的检测,将建立的合检方法与行业标准(SN/T 1022-2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法和SN/T 0173-2010进出口食品中副溶血性弧菌检验方法)进行比较,对合检方法进行效果评价。结果实验结果表明副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,与行业标准检测结果完全一致。结论该方法可靠,对实验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性,适合基础检测实验室。     

食品检测用产肠毒素大肠埃希氏菌标准物质的制备及评价

目的 制备并评价产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）标准物质。方法 分别用基质辅助激光解吸电离（MALDI-TOF MS）、生化、16 s RNA基因序列测定三种方法确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备600个ETEC标准样品（103CFU/样品）;从中随机抽取20个进行均匀性检验;模拟25℃和37℃的运输温度测试样品的运输稳定性,同时在4℃和-20℃的条件下进行保藏稳定性检验。组织3家实验室对样品进行协同验证。最后选择20件食品基质来验证样品的使用效果。结果 生化、MALDI-TOF MS、16 s RNA基因序列鉴定CMCC(B)43208为大肠埃希氏菌,lt、stp、sth基因确认其为ETEC。均匀性检验中,单因素方差分析得F=1.48,小于FINV(0.05,19,20)。稳定性检验中,在25℃和37℃保藏7 d后结果为103CFU/样品,在-20℃保藏60 d和4℃保存28 d后结果为103CFU/样品。协同标定实验中,3家实验室检测样品中菌株均为ETEC(103CFU/标准样品)。使用效果评价中,ETEC标准样品加入20种食品基质后均可检出,而本底对照均未检出。结论 本实验制备的...     

恒温荧光核酸检测与国标法在副溶血性弧菌检验能力验证中的应用与分析

目的通过参加中国食品药品检定研究院组织的副溶血性弧菌检验能力验证活动,提高实验室检测副溶血性弧菌的准确率。方法对能力验证标号为CODE1～CODE3的3组鱼蛋白粉样品,使用恒温荧光核酸技术与国标GB 4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验进行副溶血性弧菌的检测。结果使用恒温荧光核酸检出CODE2为阳性结果,与GB4789.7-2013国家标准方法检出的阳性结果一致,证明CODE2为副溶血性弧菌。结论通过此次能力验证,使得实验室副溶血性弧菌的检测能力得到了有效提高,为快速检测副溶血性弧菌提供参考。     

奶粉中沙门菌的检测能力验证研究

目的 通过组织实施奶粉中沙门菌的能力验证,对国内实验室的沙门菌检测能力进行分析和评价。方法 采用人工污染的方式制备奶粉中沙门菌能力验证样品,即菌种复苏、增菌后配制成菌悬液加入配制好的复原牛乳中混匀分装,进行冷冻干燥;对制备好的样品进行均匀性检验和稳定性检验。本次能力验证设计3组不同的能力验证样品,每个实验室随机发送2个样品,将各参加实验室提交的检测结果与指定值比较,评定各参加实验室的测试结果为满意或不满意（假阴性或假阳性）。结果 全国共337家实验室参加该项沙门菌的检测能力验证,有满意结果的实验室323家,满意率为95.8%,有不满意（假阴性和假阳性）结果的实验室14家,占比为4.2%。共向实验室发送674个样品,658个结果满意,满意率为97.6%;16个样品结果不满意（假阴性或假阳性）,占比为2.4%。结论 采用不同组别的样品随机编号且随机发样的方式,取得了良好的考核效果;本次人工污染方式制备的能力验证样品,充分考虑了目标菌、类似干扰菌和背景菌,制备的样品与实际样品一致性较好,考核效果良好。能力验证评价结果表明,全国参加考核的实验室奶粉中沙门菌检测能力总体较好,少部分实验室的检测能...     

沙门氏菌能力验证样品均匀性和稳定性评价

为了验证实验室能力验证时派发检样是否能符合验证要求,进行了样品均匀性和稳定性评价试验。以沙门氏菌为目标菌株,弗氏柠檬酸杆菌为干扰菌株,以进口无抗脱脂牛乳作为保护剂,分别制备阳性样品和阴性样品,分两批随机抽取阴性样品和阳性样品各10管,复活培养,统计目标菌在培养基上的保有量和样品检出率。结果表明:所有阴性样品中均未检出目标菌,而在所有阳性样品中均检出目标菌,表明本文制备的样品是均匀的;阳性样品沙门氏菌检出率100%,阴性样品中沙门氏菌检出率0,稳定性良好。样品能满足能力验证样品的要求。     

食品中微生物检测能力验证结果与分析

目的提高实验室检验人员微生物检测能力和水平,增强实验室竞争力。方法实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌2项检验能力验证。按照盲样作业指导书的要求对样品进行前处理后,依据GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》和GB 4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》进行定性检测。结果样品17-P842鉴定出单核细胞增生李斯特氏菌,样品18-E886鉴定出副溶血性弧菌。结论本次能力验证结果满意,为今后实验室检测实际样品提供参考经验。     

产气荚膜梭菌质控样品的研制

目的 产气荚膜梭菌是食品安全和环境监测中重点检测的致病菌之一。由于目前暂无成熟的市售产气荚膜梭菌质控菌株,本研究拟制备出能够满足要求的质控样品,可用于食品或环境领域产气荚膜梭菌检验工作中的质量控制试验和阳性对照试验。方法 依据CNAS-CL 03-A001: 2019能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明,通过菌剂的均匀性、运输稳定性、储藏稳定性等指标对制备出的菌剂进行评价。结果 在均匀性实验中F值为3.01小于临界值,5 d内4℃、15℃、25 ℃条件下的储藏稳定性和28 d内4℃、-20℃、-80℃条件下运输稳定性t值均小于临界值。结论 制备的产气荚膜梭菌质控菌株均匀性良好,储藏稳定性和运输稳定性良好,可以作为试验室质控样品使用。     

海口市市售贝类海产品副溶血性弧菌污染调查及耐药和毒力基因研究

目的了解海口市市售贝类海产品中副溶血性弧菌的污染情况、菌株血清学分型情况以及不同来源菌株的耐药情况,分析海口市市售贝类海产品受副溶血性弧菌污染的特点。方法 2014—2016年,按照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》和《国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》对五类海产品(白贝、排海、毛蚶、蛏子、芒果螺)进行副溶血性弧菌分离鉴定和血清学分型,采用实时荧光聚合酶链式反应(PCR)进行毒力基因检测,采用K-B法对分离菌株进行相关耐药分析。结果五类海产品样品共157份,其中65份样品检出副溶血性弧菌,白贝的检出率最高,为63.6%(21/33)。所分离的65株副溶血性弧菌主要血清群为O3和O5,完全分型26株,总体分型率为40.0%,其中以O1∶K25为主要血清型。65株菌对氨苄西林普遍耐药(95.4%,62/65),对头孢噻肟的中介率较高(33.8%,22/65),对8种抗生素产生了5种耐药谱。65株分离菌株神奈川试验结果均为阴性,且均未检出与致病性相关的耐热直接溶血素(TDH)及耐热相关溶血素(TRH)。结论海口市市售贝类副溶血性弧菌污染较重,应加强养殖区域海水水质的监测力度,预防副溶血性弧菌感染。     

化妆品中二苯酮-3检测能力验证研究

目的 评价实验室检测化妆品中二苯酮-3的技术能力和水平.方法 实施能力验证计划,制备2个浓度水平的参考样品,经均匀性检验和稳定性检验符合考核样品要求,样品随机发放给111家单位实验室,并收集检测数据.对反馈结果开展稳健统计分析,用Z比分数进行实验室检测能力的评价.结果 制备的样品均匀稳定,满足能力验证的计划要求.111...     

菌落总数能力验证样品均匀性和稳定性的研究

采用真空冷冻干燥方式分别制备菌落总数能力验证阳性样品与阴性样品,西林瓶真空包装、4℃冷藏贮存,制备出以脱脂奶粉为基质的均匀性好、稳定性强的菌落总数能力验证样品。通过随机抽样以评估样品的均匀性;通过观察样品在12周内不同温度下菌落总数的测试结果以评估样品的稳定性。结果表明,随机抽检的样品具有较好的均匀性;贮存温度对样品稳定性有较大影响,高温明显降低样品稳定性;通过保存温度和时间的稳定性检验显示测试结果符合预期效果,样品具有较好的稳定性。建立了有效的菌落总数能力验证样品制备的方法与评价程序。     

食品加工用水中微生物的检测能力验证关键技术研究

目的 建立一种适用于食品加工用水微生物检测能力验证方案,并进行评价。方法 对1ml菌种水悬液快速冻干制备能力验证样品,按照CNAS-GL03:2006《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》对样品进行均匀性和稳定性检验,并按照预设方案组织一次能力验证。结果 按照方案制备的样品均匀性和稳定性符合能力验证要求,参试实验室反馈的测试结果统计符合能力验证结论分布要求。结论 建立的能力验证方案可以作为一种方法来测试被监管实验室检测能力或者集团企业验证下属实验室检测能力。     

肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制

目的：为满足肠道集聚性大肠埃希氏菌准确检测的实验室质量控制和能力验证需求，研制具有我国自主知识产权且具有全基因组测序信息的均匀稳定的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质。方法：利用二代高通量测序技术对肠道集聚性大肠埃希氏菌（CMCC 44841）进行全基因组测序，明确CMCC 44841的种属、血清分型、多位点序列分型和毒力基因。对CMCC 44841进行astA、aggR、pic特征性基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球和含量为20 ng/样品的gDNA小球。参照CNAS-GL017对20 个菌球样品进行均匀性检验，采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于－20、4、25 ℃和37 ℃条件下保藏，对其贮藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织3 家实验室进行协同标定和验证。使用5 种不同基质的即食食品样本，按照国标法检验标准物质的适用性。结果：利用生物信息学分析，CMCC44841基因组大小为5.057 285 Mb，GC含量为50.6%，编码区基因5 173 个。种属鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），血清预测结果为O127:H21，MLST为ST40型，携带除aggR、astA、pic之外其他相关的毒力基因。PCR扩增出astA、aggR、pic片段大小分别为102、400 bp和1 111 bp。菌体标准物质均匀性检验结果F=1.59，符合标准物质的要求。菌体和gDNA标准物质样品于－20 ℃和4 ℃保藏60 d，25 ℃保藏7 d，37 ℃保藏5 d后仍然稳定。经3 家实验室协同标定，菌体标准物质样品含量均为103 CFU/样品。20 件不同基质的食品样品加入肠道集聚性大肠埃希氏菌标准物质进行检验，均可以检出。结论：本研究所制备的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质所用菌株来源于我国国内分离菌株，且具有明确的全基因组序列信息，均匀性和稳定性均符合要求，适用性良好，能够满足食品检测实验室的质量控制和能力验证的需求。     

双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法学研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)同时快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法。针对副溶血性弧菌tox R和霍乱弧菌omp W基因设计特异性引物,优化反应条件,建立水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测方法,并同时应用双重LAMP技术和PCR技术对实验菌株进行副溶血性弧菌和霍乱弧菌检测,比较两种方法的特异性和灵敏度。LAMP的最佳反应温度为61℃,在此条件下,双重LAMP检测技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌DNA的敏感度可达3.12 fg,且与其他常见的细菌株无交叉反应,特异性为100%;对模拟食品样品进行直接检测时检测限为50 cfu/m L;对60份水产样品进行检测时,6份样品出现LAMP及PCR阳性,而传统培养方法检测出4份阳性。实验结果表明所建立的双重LAMP技术在检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌时灵敏度、特异性高,时间成本低,适合于水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的快速检测。     

食品检测用肠道侵袭性大肠埃希氏菌标准物质的研制

目的 为满足肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC)准确检测的实验室质量控制和能力验证需求,研制具有我国自主知识产权、稳定性良好且具有清晰基因组信息背景的即用型EIEC标准物质。方法 利用二代高通量测序技术对EIEC(CMCC 44840)进行全基因组测序,明确CMCC 44840的种属、血清型、多位点序列分型(MLST)和毒力基因;采用冷冻干燥技术制备活菌含量为10³ CFU的EIEC冻干样品;参照CNAS-GL017-2018进行均匀性检验,并采用单因素方差分析对结果进行统计分析;将样品分别于-20 ℃、4 ℃、25 ℃和37 ℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输性进行评价;利用5种食品基质样本进行标准物质的使用效果验证,同时组织3家实验室进行协同标定。结果 CMCC 44840基因组大小为4.96 Mb,GC含量为50.7%,编码基因5 424个,种属鉴定结果为大肠埃希氏菌,(Escherichia coli)血清预测结果为O28ac:H7,MLST为ST311型,携带ipaH、virB、virF等毒力基因;制备的EIEC冻干样品均匀性检验结果F=1.79,符合标准物质均匀性要求;冻干样品在25 ℃和4 ℃下保藏7 d,-20 ℃和4 ℃下保藏60 d,菌含量均保持在10³CFU水平,在37 ℃下第3 d菌含量出现下降,低于10³CFU水平;添加EIEC冻干样品的20件不同食品基质样品经增菌后均检出EIEC;3家协同标定实验室测定EIEC冻干样品菌含量均为10³ CFU,且实验室间无显著性差异(F=0.59)。结论 本研究所制备的EIEC标准物质所用菌株具有清晰的基因组序列信息,均匀性和稳定性均符合要求,适用性良好,能够满足食品检测实验室的质量控制和能力验证的需求。     

沙门氏菌能力验证样品的研制及其应用

目的研制沙门氏菌分离培养及血清分型能力验证样品,并应用于沙门氏菌的能力验证。方法能力验证样品包括5瓶,其中3瓶阳性,2瓶阴性。阴性样品仅含有背景细菌,阳性样本在背景菌的基础上添加有沙门氏菌,3件阳性样品分别含有不同的血清型沙门氏菌。为防止数据串通,将参试实验室随机分成5组,每组实验室获得的质控样组合不同。为进行沙门氏菌能力验证样品评价,随机抽取冻干质控样品20瓶,参照本次能力验证推荐的GB 4789.4-2010对样品进行均匀性检验,阳性样品至少检出1种血清型沙门氏菌,阴性对照样品应不得检出沙门氏菌。将沙门氏菌能力验证样品分别在-30、4、25和37℃下储藏28 d监测其储藏稳定性。结果沙门氏菌的质控样在均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均能满足质控样使用的要求。在166家实验室反馈结果中,123家结果评定为满意,占74.1%;28家结果为不满意,占16.9%;15家结果评定为可疑,占9.0%。结论沙门氏菌的能力验证样品可以满足此次能力验证的需求,本次能力验证可以真实的反应参试单位的检测水平。     

东部沿海贝类中副溶血弧菌的分布及特征

为调查我国东部沿海城市零售贝类中副溶血弧菌的分布情况及其血清型和分子特征.共采集了288个贝类样品,采用MPN-PCR方法进行定量研究,分离得到的菌株用RAPD方法进行分子分型并考察其毒力基因携带情况.结果显示,贝类中副溶血弧菌含量季节分布明显,夏季显著高于其他季节(P＜0.05);共分离得到172株副溶血弧菌,其中1...