应用凝胶过滤筛选纯化甲型肝炎病毒介质

目的　筛选适合甲肝病毒疫苗大规模纯化凝胶过滤层析的介质。方法　采用柱层析法 ,分别以Sepharose 4FF ,Sepharose 6FF及SephacrylS 5 0 0HR三种不同的凝胶过滤介质对经过阴离子交换层析纯化的甲肝病毒样品进行纯化。结果　三种凝胶介质分离甲肝病毒的图谱不相同 ,其中以Sepharose 4FF纯化甲肝病毒 ,抗原回收率达 6 9% ,纯化倍数为 4 4倍。结论　Sepharose 4FF凝胶过滤层析可以用于甲肝灭活疫苗的大规模纯化。     

疏水作用柱层析技术纯化HBsAg条件的筛选

在应用流水作用柱层析纯化HBsAg中,对流水介质的功能基类型、交联密度、盐的浓度、操作温度等决定疏水性强弱的因素作了比较研究。结果表明,应用以C4为功能基的Butyl—Sepharose（6～8μmol／ml）和以C3为功能基的Propyl－Sepharose（20～22μmol／ml）疏水介质、8％（NH4）2SO4,18～24℃等条件纯化HBsAg时结果较理想。     

两种凝胶过滤介质纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒效果的比较

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗原及蛋白含量,计算比活性、蛋白去除率及抗原回收率,确定病毒峰收集范围。取抗原含量最高的病毒收获液,利用DEAE Sepharose FF离子交换填料进行纯化后,检测Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量。结果 Sepharose 6FF填料按6%柱体积上样进行凝胶纯化,纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液抗原回收率均值分别为78.69%、78.03%和78.37%,与Sepharose CL-6B填料按3%柱体积上样(77.29%、78.60%和77.36%)相比,差异无统计学意义(P0.05)。两种填料纯化的各型收获液再经离子交换纯化后,蛋白去除率、比活性、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,两种填料纯化的各型收获液比活性差异无统计学意义(P0.05)。结论使用Sepharose 6FF纯化的各型病毒纯化液抗原回收率和比活性与Sepharose CL-6B无明显差异,但可以减少纯化的上样次数,大幅提高纯化效率,可用Sepharose 6FF替换Sepharose CL-6B。     

双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)的纯化工艺

目的　研究肾综合征出血热抗原的纯化工艺。方法　用Vero细胞繁殖肾综合征出血热病毒 ,经过灭活、浓缩 ,Sepharose 4FF凝胶过滤纯化。结果　用Sepharose 4FF柱层析纯化时 ,2 80nm监测收集到 3个吸收峰 ,其中第 1峰为抗原峰 ,将第 1峰稀释配制后进行动物实验 ,表明按照该工艺制备的Vero细胞纯化疫苗安全有效。结论　本研究为肾综合征出血热纯化疫苗的研制奠定了基础。     

超大孔聚苯乙烯微球固定蛋白质

采用琼脂糖对孔径为300~500 nm的超大孔聚苯乙烯(MPS)微球进行亲水化修饰,并在修饰后的表面上偶联病毒蛋白颗粒(RV),用于蛋白质的分离纯化实验. 结果表明,经过修饰的MPS层析介质具有优异的流体力学性能,层析过程的最高流速可达1120 cm/h,对病毒蛋白颗粒的固定量为0.638 mg/g,是商品化介质Sepharose 4FF的2倍. 采用RV-MPS介质对病毒蛋白颗粒抗体进行了分离纯化,收率为29.22%,高于Sepharose 4FF的18.92%.     

长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的纯化及质量检测

长白白眉蝮蛇原毒经DEAE Sepharose FF ,CM Sepharose FF和G Sepharose CL 6B层析后 ,制得长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶精品。该产品经质量检测完全符合卫生部颁发的质量标准 ,该工艺适合于大规模纯化长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶。     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的 建立一种有效的方法，从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）。方法重组大肠杆菌发酵后，表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性，采用Q Sepharose Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化。使用 SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用 ELISA和 Western－bloning对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后，rUreB的纯度＞70％。包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95％。rUreB纯品具有良好的生物学活性。结论 建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺，为进一步的研究打下了基础。     

柱层析法纯化基因工程HBsAg中试工艺的研究

由乙肝病毒S基因转化的哺乳动物细胞培养收液，经过Butyl-S-SepharoseFF层析，DEAESepharoseFF层析和Sepharose4FF层析，可获HBsAg纯品。产品检定结果表明，PAGE和SDS-PAGE电泳纯度均合格，小牛血清残余量、细胞DNA残余量和动物免疫效力也均符合规定标准．HBsAg终收率达40％左右．在此工艺中，疏水作用柱层析的纯化效率比较高，可去除绝大部分杂蛋白和细胞DNA。     

胸腺肽纯化工艺的改进

目的 建立高效、快速、简便的纯化胸腺肽方法,以便提高胸腺素α1含量及活性,减少过敏反应。方法 采用 DEAE Sepharose FF、CM-Sephrose两种串联柱层析纯化。结果 纯化后的胸腺肽电泳结果出现明显的胸腺素α1带、玫瑰花结率可达33％(绝对值)以上,相对分子质量明显在3 100左右,无过敏反应。结论 建立了高效、规模化的胸腺肽纯化方法,提高了胸腺肽质量。     

自制填充介质对人血浆凝血因子Ⅸ的层析分离

目的采用自制的DEAE Bio-SepFF和肝素Bio-Sep FF介质,从人血浆中快速分离纯化凝血因子Ⅸ(FⅨ)。方法低温离心去除冷沉淀后的人血浆,在不同淋洗条件下,经过两步弱阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FⅨ,用活性检测试剂盒检测各组分凝血因子的活性,Bradford法测定蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品的纯度。结果经过三步层析分离,得到的FⅨ比活达到99.40IU/mg,纯化倍数为3823倍,回收率约为30%,纯度较高。结论采用该方法和介质,可从人血浆中纯化FⅨ,且效果较好。     

两种方法纯化流感病毒的比较

目的比较两种方法纯化流感病毒的效果。方法取病毒原液,经超滤浓缩后,分别用Sepharose 4FF凝胶层析和蔗糖密度梯度离心法进行纯化,并对纯化产物进行检定。结果层析法的纯度、卵清蛋白及杂蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度离心法,而蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率优于层析法。结论两种方法均可用于流感病毒的纯化。     

不同色谱介质用于鼠腹水中低等电点单克隆抗体的纯化

从一低等电点单克隆抗体（C50,CEA单抗）鼠腹水中纯化单抗,对10种色谱介质在其离子强度、pH、流速等最佳的条件下的纯化效果进行了对比,结果表明腹水先用40％饱和硫酸铵处理后,经一次色谱柱纯化,纯度可达83．6％～96％,回收率为50％～94％。在各种阴离子交换介质中,QSepharoseFF的效果最好,弱阴离子交换介质WhatmanDE52的效果较差。尽管两种强阳离子交换介质的效果较好,但劣于QSepharoseFF及亲会色谱介质HiTrapProteinG。Poros50A纯化IgG1类单抗时需要较高的盐浓度,不能作为最佳候选介质。SephacrylS-200HR及PhenylSepharose6FF纯化产物回收率及纯度均较低,不适于该单抗的纯化。     

应用液相色谱法分离纯化固相化学合成胸腺素α1

引　言胸腺素α1(Tα1)是由 2 8个氨基酸组成的小分子多肽[1] ,它能够促进淋巴T细胞分化、成熟 ,增强机体的免疫功能 ,临床上主要用于治疗乙肝等病毒性肝炎 ,也可作为艾滋病和恶性肿瘤的辅助药物[2～ 4 ] .目前 ,我国所使用的胸腺素α1主要依靠进口 ,其昂贵的价格限制了胸腺素α1在我国的使用 .因此 ,依靠自己的技术生产相对便宜的胸腺素α1,实现胸腺素α1的国产化 ,具有重大的理论价值和应用价值多肽化学合成技术目前已较为成熟[5,6 ] ,本研究室应用DIC/Fmoc固相化学合成技术 ,已得出一条简便、高效的胸腺素α1合成路线 .但是 ,化学合成的多肽往往含有大量的杂质 ,令人棘手的是小部分杂质与目标物在分子结构和化学性质上十分相　似 ,给多肽的分离纯化带来了困难 .液相层析法在多肽的分离纯化中显示出优越的分离能力[7～ 9] ,对于固相合成的胸腺素α1粗品 ,本实验综合应用离子交换制备色谱和反相高效液相制备色谱在选择性上的差异成功地分离纯化出高质量的胸腺素α1.分离时先采用离子交换制备色谱除去粗品中的大部分杂质 ,再用反相高效液相制备色谱作进一步的纯化 ,所得的样品通过分析型反相高效液相色谱分析...     

Optimization of conditions for single-step purification of recombinant hepatitis B surface antigen produced in Pichia pastoris using ion exchange chromatography

ABSTRACT

The adsorption and release of rHBsAg extracted from the final dosage form on various ion exchange resins and under different pH conditions were investigated after its peptide map and isoelectric point (PI) determination. Efficient antigen adsorption to the anion exchange resins occurred when the pH value of the protein buffer was adjusted to 5.0. In purification of rHBsAg derived from the yeast crude extract using Q Sepharose FF column, with adjusting the pH value of the crude extract to 5.0 (i.e., near to the target protein PI) and using 2M NaCl, rHBsAg with high purity (up to >95%) was obtained.

Abbreviations: rHBsAg, recombinant hepatitis B surface antigen; Alhydrogel, aluminum hydroxide; IEF, isoelectric focusing; PI, isoelectric point; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; RP-HPLC, reversed-phase high-performance liquid chromatography; SE-HPLC, size-exclusion high-performance liquid chromatography; PBS, phosphate-buffered saline     

肾综合征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗纯化方法的研究

目的 建立简便、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。方法 采用超滤浓缩、醋酸锌沉淀和柱层析（亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析）等方法，对出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗进行提纯对比试验。结果 用超滤浓缩和Sepharose 4FF凝胶柱层析或用醋酸锌沉淀和凝胶柱层析，纯化的疫苗均可达到质量标准，而用 cellufine sulfate gel亲和层析和离子交换层析均不理想。结论 建立了经济、适合大规模肾综合征出血热灭活疫苗的纯化方法。     

幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定

目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因,重叠延伸PCR法将两段基因拼接,T-A克隆后,构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB,经酶切鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出206bp和336bp的目的片段,重叠延伸PCR扩增出524bp的融合目的基因片段。原核表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定,与设计序列一致。重组工程菌pET-22b(+)-Uepi-LTB/BL21经IPTG诱导,目的蛋白表达率约25%,SDS-PAGE分析相对分子质量约20000,目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达96%,Westernblot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合。结论HpUreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆,可获得高效表达,并显示出较好的免疫活性,为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。     

重组人血清白蛋白-干扰素β融合蛋白的分离纯化及质控方法的建立

目的建立中试制备重组人血清白蛋白-干扰素β(Recombinant human serum albumin-interferonβ,rHSA-IFNβ)融合蛋白的纯化工艺及质控方法。方法采用50 L发酵罐诱导表达rHSA-IFNβ融合蛋白,发酵液经超滤浓缩及脱盐后,再经BlueSepharose FF亲和层析、G25凝胶过滤层析和SP Sepharose FF阳离子交换层析纯化。SDS-PAGE(银染法)和HPLC测定融合蛋白纯度,Western blot分析反应原性,质谱法测定相对分子质量,Edman降解法测定N-末端氨基酸序列,等电聚焦电泳法测定等电点,细胞病变抑制法测定rHSA-IFNβ融合蛋白的生物学活性,其余检测项目均按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果纯化的3批融合蛋白纯度可达96%以上,具有人血清白蛋白和人干扰素β的双重反应原性,相对分子质量分别为89 070、89 035和88 669,N-末端氨基酸序列为:NH2-D-A-H-K-S,等电点为6.34,比活性分别为1.9×106、1.5×106和1.1×106IU/mg,其余各项指标均符合要求。结论已成功建立了中试制备rHSA-IFNβ融合蛋白的纯化工艺及质控方法。     

重组铜绿假单胞菌外毒素A工程菌发酵及表达产物的纯化

目的建立稳定、高效表达重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)的工程菌发酵及表达产物纯化工艺。方法规模化发酵表达rEPA的重组大肠杆菌rPE553D,离心收集菌体,渗透压调解使菌体周质间隙蛋白释放后,高速离心收集蛋白溶液。经DEAESepharoseFF、PhenylSepharose6FF疏水层析和SOURCE30Q强离子交换层析,超滤浓缩纯化rEPA。用HPLC、SDS-PAGE和Westernblot等方法检定生化和免疫学特性,并用小鼠和Vero细胞检定毒性。结果每55L培养基中rEPA产量超过4g,纯度在95%以上,细胞毒性降低了至少32000倍。其余各项指标均符合《中国生物制品规程》要求。结论已建立了收率高、纯度好、稳定、适合规模化生产rEPA的工艺。