基于ARTP技术选育维生素K2优势菌株及发酵培养基优化

本研究目的在于获得维生素K₂优势突变株,并利用响应面设计优化发酵培养基进一步提高其产量。采取常压室温等离子体诱变技术结合结构类似物抗性初筛、24孔板发酵复筛,对纳豆芽孢杆菌进行诱变选育,并应用Box-Behnken设计对发酵培养基进行优化。通过ARTP诱变选育得到一株维生素K₂优势突变株,维生素K2产量较初始菌株提高了3.23倍。Box-Behnken实验优化后,最佳值为K₂HPO₄（0.69 g/L）,甘油（66.01 g/L）和酵母粉（25.12 g/L）,发酵后维生素K₂产量较优化前提高了56.7%。通过ARPT技术诱变选育出一株维生素K2优势突变株,采用响应面法优化发酵培养基。实验结果表明,突变株具有潜在的生产应用价值,建立的育种方法也可为其他工业微生物的选育提供有益的参考,对提高人们的健康水平具有十分重要的意义。     

优化灵芝真菌发酵条件的研究

通过摇瓶试验研究确定转速、接种量、通气量为影响灵芝真菌罐上发酵培养的影响因素,以菌体量、胞外多糖产量为目的产物,利用L9（34）正交试验进行7L发酵罐发酵条件优化,分析得出灵芝真菌培养的最佳工艺条件为：转速200r／min、接种量15％、通气量200L／h;菌丝体最大产量为7．35g／L,胞外多糖干重最高产量为0．92g／L。菌体量与胞体多糖产量存在线性关系,得到回归方程为y=0．0275x＋0．5968。     

两阶段转速控制对粪肠乳酸球菌合成γ-氨基丁酸的影响

为进一步提高粪肠乳酸球菌合成γ-氨基丁酸(GABA)的产量,在250 m L摇瓶水平上考察了转速(0和100 r/min)对菌体生长和产物合成的影响。通过分析不同转速下发酵曲线和动力学参数,提出两阶段转速调控策略,并对影响此调控策略的发酵条件(阶段时间、装液量及转速)进行正交优化。72 h、0 r/min产量最高,稳定期、100 r/min生物量最高。优化后发酵条件为装液量100 m L,在发酵前期(0～12 h)控制转速150 r/min,发酵后期(12～72 h)控制转速0 r/min;在此基础上,GABA产量达到(6. 713±0. 135) g/L,比优化前(0和100 r/min)分别提高了12. 2%与60. 1%。两阶段转速控制策略可以有效提高粪肠乳酸球菌合成GABA的能力,对GABA工业化生产具有重要的参考价值和指导意义。     

细脚虫草多糖液体发酵及分离纯化工艺研究

用Box-Behnken中心组合试验设计和单因素试验对虫草多糖发酵工艺、水提醇沉工艺及脱蛋白工艺进行优化。结果表明:细脚虫草最佳发酵工艺条件为葡萄糖33.3 g/L、蛋白胨29.2 g/L、接种量3.9%。胞外多糖最佳提取工艺条件为浓缩,加3倍乙醇,pH为6.0,沉淀24 h;胞内多糖最佳提取工艺条件为浸提比(m_菌丝∶V_水)1∶40 (g/mL),提取时间90 min,浸提次数2次,浸提温度80 ℃。多糖纯化中Sevage法脱蛋白的最佳工艺为氯仿与正丁醇配比(V_氯仿∶V_正丁醇)4∶1、Sevage试剂与发酵液配比(Vsevge_试剂∶V_发酵液)1∶2、振摇时间15 min、脱蛋白次数3次。优化后胞外多糖产量提高了37.89%,胞内多糖产量提高了24.59%,纯化后蛋白脱除率在75%以上。     

灵芝菌体液态深层发酵条件的优化

研究摇瓶灵芝菌体液态深层发酵温度和初始pH 值,在此基础上进行5L 发酵罐批次培养,研究发酵过程pH 值控制、溶氧控制对灵芝菌体生长和灵芝胞外多糖的影响。结果表明：发酵温度30℃,初始pH 值为6.0;过程pH 值控制策略：菌体生长前期(0～40h)控制pH 值为5.5,40～48h 控制pH 5.0,48h 后至发酵结束控制pH4.5;溶氧控制策略为：搅拌转速160r/min,通风量0.75vvm。优化后的验证实验结果：灵芝菌体生物量最高达到19.7g/L,胞外多糖最高达到3.23g/L,较优化前灵芝菌体生物量12.8g/L 和灵芝胞外多糖2.39g/L 分别提高了53.9% 和35.1%。     

2-酮基-L-古龙酸一步发酵生产菌株发酵过程优化

对1株可以一步发酵生产维生素C直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG)的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌株(Gluconobacter oxydans–ss)的发酵条件进行优化,以提高其发酵效率。结合Box-Behnken实验和响应面法对其初始发酵培养基进行优化,得到优化的发酵培养基组成:山梨醇158.0 g/L,酵母膏18.0 g/L,初始p H5.0。采用该优化培养基在3 L全自动发酵罐上进行发酵过程控制。在考察不同转速对2-KLG积累过程影响的基础上,进一步提出分阶段转速控制策略:即发酵前期(0~48 h)转速控制在600 r/min,48 h至发酵结束转速控制在500 r/min。应用该策略,2-KLG产量达到34.86 g/L,生产强度为0.36 g/(L·h),其分别比恒定转速发酵时2-KLG的最大产量提高24.01%和24.14%。     

蛹虫草深层培养联产纤溶酶和菌丝体的比拟放大研究

以溶氧速率常数KLa相等为放大原则,研究了从摇瓶培养至10L和100L发酵罐培养的规律,试验结果表明:在10L发酵罐中搅拌转速为50r/min且通风量为0.7m3/h时、搅拌转速为100r/min且通风量为0.6m3/h时、搅拌转速150r/min且通风量0.5m3/h时的KLa值与摇瓶优化条件下的KLa值一致;在100L发酵罐中搅拌转速为100r/min且通风量为3m3/h时、搅拌转速为150r/min且通风量为2m3/h时的KLa值与摇瓶优化条件下的KLa值一致。发酵试验验证在10L发酵罐中,搅拌转速为100r/min,通风量为0.6m3/h时发酵结果与摇瓶优化条件下的发酵结果一致。在100L发酵罐中,当搅拌转速为150r/min,通风量为2m3/h时,菌丝体产量达到了摇瓶优化结果。     

纺锤形赖氨酸芽孢杆菌P-3产胞外多糖发酵工艺参数优化

利用响应面法对纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3产胞外多糖（EPS）发酵工艺参数进行了优化。通过单因素试验筛选到显著因素,对显著因素进行Box-Behnken中心组合试验设计优化,建立EPS产量与各因素的多元回归方程;最终确定最佳发酵工艺参数为接种量3%、初始pH 7、发酵温度34 ℃、发酵时间32 h和转速161 r/min。在此优化条件下,EPS平均产量为2.92 g/L。     

裂褶菌菌丝体与胞外多糖发酵条件研究

在7 L发酵罐上进行了裂褶菌发酵生产菌丝体和胞外多糖的研究,采用L_9(3~4)正交试验对发酵条件进行了优化。在7 L发酵罐上裂褶菌的适宜培养条件为:搅拌转速200 r/min、接种量10%(V/V)、通气量200 L/ h,在此条件下发酵120 h,获得的菌丝体和胞外多糖产量最高,分别为16.23 g/L和1.68 g/L。相关性分析表明,裂褶菌菌丝体产量与胞外多糖产量之间存在线性关系。     

pH及溶氧对重组大肠杆菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的影响

以重组大肠杆菌DALA为实验菌株,研究了该菌株在机械搅拌通风发酵罐发酵过程中pH以及溶解氧对5-氨基乙酰丙酸（ALA）积累的影响。结果发现,发酵前期（0～27 h）pH保持为6.5;稳定期后期（28～48 h）,pH为6.0时有利于5-ALA的积累。其次,通过控制转速与通气量调节发酵液中的溶氧,发现发酵前期转速为500 r/min,通气量为2 vvm;稳定期后期,转速降低至250 r/min,通气量减少为1 vvm,有利于重组菌DALA发酵生产5-ALA,在此条件下发酵5-ALA的产量可达到3.46 g/L。     

枯草芽孢杆菌P spovG启动子改造与表征

枯草芽孢杆菌是重要的工业生产菌株,广泛应用于外源蛋白质的表达。目前在枯草芽孢杆菌中常见组成型启动子中,P_spovG作为高强度组成型启动子在表达外源蛋白质时,具有表达量高、稳定性好和适用范围广等优势。作者首先对P_spovG上游序列截短,发现将启动子上游序列由原来的251个碱基缩短为26个,仍能保持启动子强度不降低,并确定了紧邻-35元件上游的3个碱基“AGC”为影响启动子强度的关键碱基。其次对启动子的上游A-T富含区以及spacer区域的G-C富含区进行随机突变,证明了上游激活序列中A-T碱基的排列对启动子强度有重要影响,并得到了强度提高的突变体。最后通过将不同表达时期启动子的关键调控序列分别插入突变体的上下游,得到了启动子强度为原始启动子135.1%的新型启动子SP_spovG-P_lytR。本研究为枯草芽孢杆菌表达系统开发新型强组成型启动子提供了重要的参考。     

布氏乳杆菌细菌素BSX01对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成的影响

为评估布氏乳杆菌所产细菌素在食品工业中的应用潜力，通过培养布氏乳杆菌获得具有抑制金黄色葡萄球菌的抑菌活性物质，经纯化后鉴定其相对分子质量大小与抑菌特性，并对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成进行探讨。结果发现，布氏乳杆菌在37 ℃ MRS培养基中培养至20 h后进入稳定期，在26 h时对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达峰值，为（26.36±0.86） mm。 通过АKTA pure系统串联Superdex 30 Increase纯化后，鉴定得到抑菌活性物质（BSX01）的相对分子质量为773.56，对多种蛋白酶敏感，推测为Ⅰ类细菌素。在pH 10(2 h)和121 ℃(30 min)处理后，BSX01仍具有较好的抑菌活性，最小抑菌质量浓度（MIC）仅为12.50 μg/mL。此外，BSX01在1/2 MIC时可有效降低金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，在2 MIC时能够完全抑制生物被膜的形成。基于上述结果，布氏乳杆菌产生的细菌素BSX01是食品工业中的潜在生物防腐剂和抑制食源性致病菌生物被膜形成的有效候选品。     

含水量对新疆鲜食核桃贮藏期黄曲霉生长及黄曲霉毒素M1积累的影响

目的:提高新疆鲜食核桃的贮藏安全性。方法:以新疆“新2”薄皮核桃为材料，无菌水接种为对照组，黄曲霉菌接种为试验组，将从自然霉变核桃上分离纯化出的黄曲霉菌人工接种至不同含水量(10%,15%,20%,25%,30%)的新疆薄皮鲜食核桃上，探究黄曲霉菌生长量及产毒变化情况。结果:最适宜黄曲霉菌生长繁殖并分泌黄曲霉毒素M₁的核桃含水量为15%;随着核桃含水量的升高，黄曲霉菌生长量呈先上升后下降趋势，但各含水量之间的生长量各不相同，且黄曲霉菌生长量与产生黄曲霉毒素M₁的量成正比。结论:原料的含水量与黄曲霉菌生长量及产生黄曲霉毒素M₁的量有着密切的关系。     

农杆菌介导转化黑曲霉条件优化及脂肪酶表达

优化了农杆菌介导转化黑曲霉的方法,优化条件包括共培养材料、农杆菌种类、诱导剂浓度、共培养时间、共培养温度以及共培养时农杆菌的菌体浓度。结果表明,农杆菌介导转化黑曲霉的最适条件为107个/mL不萌发的新鲜孢子与OD_(600)培养至0.9～1.0的农杆菌以1∶1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol/L的IM平板上,23℃避光培养48 h后进行转膜,转化子个数可达到(60±5)个转化子/10~6个孢子,且阳性率达到90%以上。并且构建了同源黑曲霉脂肪酶的组成型和诱导型启动子表达载体,通过优化后的农杆菌介导转化方法转化至黑曲霉中,利用罗丹明橄榄油平板对产酶转化子进行筛选鉴定,并获得了阳性克隆。     

链霉菌SG17代谢产物对玉米黄曲霉的抑制作用及其稳定性分析

黄曲霉是玉米贮存过程中主要的污染之一,直接影响食品以及饲料的品质和安全.利用微生物及其代谢产物进行生物防治具有广泛的应用价值.作者以前期筛选获得的SG17菌株为材料,通过形态学观察、生理生化检测及16S rRNA序列分析,初步确定为链霉菌;平板对峙实验显示该菌株能够显著抑制黄曲霉等多种病原真菌的生长,具有一定的广谱性;...     

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D--阿洛酮糖是D--果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D--阿洛酮糖 3-差向异构酶（D--psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase）能够催化D--果糖生产D--阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D--阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧（DO）、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为：DO为30%、pH 6.0、温度37 ℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为：在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/（L·h）,在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。     

三孢布拉霉遗传转化体系的构建及应用

为解决三孢布拉霉转化过程中原生质体转化率低、孢子细胞壁厚难以导入外源载体等问题,本研究中构建了根癌农杆菌侵染原生质体的转化体系,同时克隆了与非同源末端连接修复途径相关的ku80基因,并将该转化体系应用于ku80的敲除中.将ku80基因敲除框插入双元载体pDHt-sk上构建了重组敲除载体pDH-85H3,通过化学转化法将...     

纳米Ag@TiO2、Fe@TiO2和Zn@TiO2的抑菌活性比较研究

探索常见金属离子掺杂对抑菌片的抑菌性能的影响,为新型纳米TiO₂抑菌片的制备与改善提供技术基础。选择固定质量分数的Ag⁺、Zn²⁺和Fe³⁺掺杂TiO₂,通过抑菌圈、MIC与MBC方法综合评价其抑菌性能,对微观结构进行表征分析,探讨抑菌性能差异的原因。结果表明:抑菌性能大小顺序为Ag@TiO₂> Zn@TiO₂> Fe@TiO₂,Zn@TiO2 的抑菌活性较好但抑菌稳定性差Ag@TiO2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC、MBC均是10、20 mg/L,Zn@TiO₂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC、MBC均是30、50 mg/L。表征发现抑菌活性强弱主要归因于纳米TiO₂表面与金属离子共同产生的活性位点数量及稳定性,与孔结构或表面宫能团的关联不大。     

16S与gyrB基因联合建树快速鉴定一株蜡样芽孢杆菌

开发一种可用于保守序列相似度较高的菌群快速鉴定的方法,并用其鉴定一株从土壤采集的芽孢杆菌。从厦门市同安国家农业科技园区施用动物肥的种植区采集土壤,稀释涂布平板,分离纯化菌株后,扩增16S与gyrB基因序列并测序,在Genbank选择序列相似的ATCC菌株进行比对,将16S序列与gyrB序列线性拼接后,利用Paup* 4.0构建进化树,通过生理生化实验对鉴定结果进行验证。在16S序列与gyrB基因序列单独建树均无法鉴定到种的情况下,通过16S与gyrB碱基线性拼接序列联合建树,将土壤中分离得到的芽孢杆菌HX2016002鉴定为蜡样芽孢杆菌,该方法所构建的进化树自展值高,鉴定结果与生理生化实验一致。对Genbank中已知的蜡样芽孢杆菌序列建树分析表明,该方法在蜡样芽孢杆菌中具有普适性。利用16S与gyrB基因拼接序列联合建树,在保守序列相似度高的属内菌种鉴定中具有进一步研究的价值。