人甲胎蛋白 AFP 在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

纤溶活性重组纳豆激酶在大肠杆菌中的表达

通过PCR方法扩增纳豆激酶成熟肽和纳豆激酶酶原(proNK)基因片段,并分别克隆到表达载体pET28a上,构建与His标签融合表达的重组表达质粒pET28a-NK和pET28a-proNK,转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和纤维蛋白平板检测目的蛋白的表达及表达产物的纤溶活性.结果表明,纳豆激酶成熟肽基因在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在,表达产物没有纤溶活性;纳豆激酶酶原基因在大肠杆菌中的表达产物能自我剪切,形成有纤溶活性的纳豆激酶,但同时对宿主细胞有降解毒性.     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

第一类整合酶表达载体的构建及鉴定

Inti1基因是编码整合酶的基因,采用PCR方法对Inti1基因片断进行扩增,扩增子采用Ned1和BamH1双酶切,并克隆到pET19b载体上.把构建好的载体转化至E.coli BL21(DE3)中,在IPTG下进行诱导表达.经SDS-PAGE电泳鉴定以及使用特异性抗His-整合酶单克隆抗体的Western-Bloting证明该重组E.coli BL21(DE3)-Inti1在IPTG诱导下可表达整合酶,此为整合酶表达调控研究奠定了基础.     

重组大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶的pET载体的选择及乳糖诱导作用的初步研究

采用PCR技术以E.coliK-12基因组DNA为模板扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因,克隆至原核表达载体pET28(a)和pET32(a)中,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导,由T7 lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究.在对诱导条件进行优化控制的前提下,分析比较了乳糖诱导pET28(a)/]-ggt和pET32(a)/γ-ggt两种重组质粒表达大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶蛋白的可溶性及酶活.实验结果表明,对于T7lac启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,低温培养下,乳糖诱导pET32(a)/γ-ggt重组质粒表达γ-谷氨酰转肽酶具有更高的蛋白可溶性和酶活. 杆茵BL21(DE3),借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导,由T7 lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究.在对诱导条件进行优化控制的前提下,分析比较了乳糖诱导pET28(a)/]-ggt和pET32(a)/γ-ggt两种重组质粒表达大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶蛋白的可溶性及酶活.实验结果表明,对于T7lac启动子控制的重组目 产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,低温培养下,乳糖诱导pET3     

栖热袍菌α-葡糖苷酶的基因克隆表达及酶学性质

用分子克隆手段获得栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)中的α-葡糖苷酶基因,构建该基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以Thermotoga neapolitana DSM 4359的α-葡糖苷酶基因DNA为模板,通过PCR扩增目的基因,并连接至表达载体中,构建重组质粒pET-28a-glu,然后转化到大肠杆菌中,加IPTG诱导获得重组蛋白。提取粗酶,用葡萄糖测定试剂盒测酶活。序列分析结果表明,该基因的读码框碱基长度为2166bp,编码722个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明,α-葡糖苷酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,蛋白分子量约为62KDa;酶的最适反应温度为70℃,最适pH为5.0。     

嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC的克隆及组氨酸融合酶蛋白的表达

应用PCR扩增嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC,重组至原核表达载体pET30b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达的重组乙醛脱氢酶在碳端含有一个组氨酸标签。SDS-PAGE考察蛋白的表达量和亚基分子量,并对Km值进行了考察。成功构建了pET30b-aldC原核表达质粒;诱导表达了亚基分子量约为56 kDa的组氨酸融合蛋白;乙醛脱氢酶活性比对照菌增加了约3.5倍;Km值为2.874 mmol/L。成功克隆并诱导表达了含组氨酸标签的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并通过SDS-PAGE和western blot来鉴定表达产物。随后用Ni-NTA螯合亲和层析的方法纯化重组蛋白,并测定该酶的米氏常数,用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性。最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功,表达产物在SDS-PAGE和western blot图的25 kD左右,与prx1真实的蛋白分子量相符,说明Prx1蛋白成功表达。Prx1纯化后产量达到7.59 mg/g菌体,纯度达到88.50%。纯化后的Prx1在37℃和pH 7.4的条件下催化H2O2反应的米氏常数Km为2.06×10-4 mol/L,质粒保护实验表明Prx1可以保护pUC18质粒免受氧化损伤。因此,Prx1在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活性蛋白。     

三聚氰胺脱氨酶基因克隆表达及活性测定

从载体pUC57-MDA中获得经过大肠杆菌密码子偏好性优化的三聚氰胺脱氨酶编码基因,将该基因连接至表达载体6HisT-pRSET中,构建了重组表达质粒6HisT-pRSET-MDA,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌BL-MDA并进行诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析并测定酶活性。SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达上清液在53 000处有明显的蛋白质条带,与理论相对分子质量的吻合,其脱氨酶活性达5.61 U。     

表面活性肽在大肠杆菌中的异源表达

为构建新型表面活性肽的表达载体,并探讨其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化,将编码新型活性肽A₆K的重复DNA片段(A₆K)₁₅分别插入到4中不同的原核表达载体中,经酶切和测序验证后,转化到3种不同的表达宿主进行表达,通过改变异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)浓度、诱导温度和时间来优化表达条件。表达产物通过镍-次氮基三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA)螯合层析进行纯化,通过(A₆K)₁₅上的6×His与抗体特异性结合进行Western blot分析,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定产物浓度,进行经济效益分析。构建了含有目的基因(A₆K)₁₅的重组表达质粒,筛选出最优载体pET-28a-SUMO-(A₆K)₁₅和最优宿主BL21(DE3)。当IP...     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

SrtA蛋白在大肠杆菌中的高效表达与活性鉴定

按大肠杆菌偏好优化密码子并合成高活性突变型srtA基因,构建Trx蛋白共表达载体pTIG-srtA,转入大肠杆菌BL21（DE3）后低温诱导表达,通过Ni2+柱亲和层析纯化SrtA蛋白,连接LH_N-LPETG和G-H_C蛋白检测SrtA蛋白活性。菌液PCR鉴定和测定序列比对结果显示,构建pTIG-srtA载体成功;SDS-PAGE及Western Blot分析结果显示,在大肠杆菌中实现了SrtA蛋白的可溶性高表达,Ni2+柱亲和层析后得到纯度大于95%的SrtA蛋白,LH_N-LPETG和G-H_C蛋白成功连接表明,原核系统表达纯化的SrtA蛋白具有良好的转肽酶活性。     

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.     

丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探

为了高效制备抗冻肽,研究一种丝胶抗冻肽目的基因SerD在大肠杆菌BL21菌株中的重组表达,并分析表达产物的抗冻活性。首先合成SerD基因片段,经KpnI和XhoI双酶切后定向插入质粒载体Pet32a中,构建表达质粒Pet32a-SerD,然后电转化入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的基因表达,利用镍琼脂糖亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,并对其进行抗冻活性分析。结果表明,最佳表达条件为重组菌在20℃诱导16 h;通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹试验(Western-Blot)鉴定重组蛋白表达成功且His-SerD融合蛋白表达的分子量在25~35 kDa之间;胞内表达His-SerD融合蛋白的大肠杆菌BL21-SerD复苏后的生长活性明显高于PBL空载菌;添加His-SerD融合蛋白可明显降低溶液中冰晶颗粒大小,具有较好的重结晶抑制效果。本文通过基因工程方法在大肠杆菌中成功构建丝胶肽抗冻肽的重组表达系统,并最终获得具有抗冷冻胁迫保护作用的His-SerD融合蛋白。     

中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05 α-淀粉酶基因的克隆和原核表达

本实验室从新疆盐湖分离得到一株产α-淀粉酶中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05,根据已报道的α-淀粉酶基因(α-AMY)序列的保守区域设计引物,从中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05基因组中扩增出α-淀粉酶基因片段,将α-淀粉酶基因纯化后克隆到pGM-T载体上测序,结果表明α-淀粉酶基因片段长约1500bp,与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的α-淀粉酶基因序列的同源性为95%,两种序列具有一定的同源性。按正确的阅读框架将α-淀粉酶基因片段定向克隆到表达载体pET-32a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,α-淀粉酶基因能在大肠杆菌BL21中成功表达,确定表达蛋白的相对分子量为61kD左右,与理论推导的分子量相一致;构建的大肠杆菌工程菌,所产生的α-淀粉酶是包涵体,通过超声波粉碎仪粉碎后,测α-淀粉酶酶活为原菌的1.8倍。