柠檬酸钠对L-亮氨酸发酵代谢流分布的影响

应用代谢流分析方法研究了柠檬酸钠对L-亮氨酸发酵中后期胞内代谢流分布的影响.结果表明:在L-亮氨酸分批发酵过程中,未添加柠檬酸钠时合成L-亮氨酸的代谢流量为25.4:在初始发酵培养基中添加2.0g·L-1柠檬酸钠后,合成副产物L-丙氨酸和HAc的代谢流量明显减少,分别降低了13.6%和63.4%,葡萄糖的供给受到限制,EMP途径代谢流从97.7减弱至87.1,而L-亮氨酸生物合成的代谢流增长至30.2,较未添加前提高了18.9%.因此发酵过程中添加柠檬酸钠能够改变L-亮氨酸生物合成途径的关键节点丙酮酸及乙酰辅酶A的代谢流分布,保持EMP和TCA之间代谢流量平衡,有利于减少副产物的生成,提高L-亮氨酸生物合成途径的代谢流量.     

应用代谢通量法分析花生四烯酸的合成过程

代谢通量分布分析已经成为研究发酵过程特性的有效方法.今建立了花生四烯酸(AA)在高山被孢霉ME-1(Mortierella alpina ME-1)体内合成的代谢通量模型,求解不同氮源浓度下发酵各时期的碳流分布.充足氮源发酵时,指数生长期、减速期、稳定期流向AA的碳流分别占总碳流的3.28%,8.80%,6.97%.而通过限制性氮源发酵并在96 h补加0.05%的NaNO3成功地引导了发酵碳流迁移,将各时期流向AA的碳流提高至3.95%,19.21%,39.29%,并最终实现AA产量从1.3 g·L-1提高到3.5 g·L-1.这些结果表明限制性氮源发酵并在稳定期补加低浓度的氮源能显著提高AA产量.     

产朊假丝酵母分批发酵生产谷胱甘肽的代谢通量分析

根据产朊假丝酵母利用葡萄糖作为惟一碳源生物合成谷胱甘肽的代谢网络,利用代谢通量分析方法分析了谷胱甘肽分批发酵不同阶段各代谢途径碳通量的分布和变化规律.在此基础上,通过分阶段温度控制和L-半胱氨酸添加等策略,调节谷胱甘肽分批发酵过程中的代谢通量分布,谷胱甘肽生物合成的产量明显提高,最大增加幅度分别达到23%和91%.同时对这些策略下谷胱甘肽的过量合成机理进行了解释.     

溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其代谢流迁移的影响

为有效降低L-苏氨酸发酵过程中副产物的积累,考察了发酵过程中的溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其多种副产物积累的影响,并深入探讨了振荡行为对L-苏氨酸生物合成代谢网络的代谢流分布的影响。结果表明:采用溶氧强制振荡工艺能够明显提高L-苏氨酸的发酵产率和降低多种抑制性产物的合成。与非振荡工艺相比,经过36h培养,细胞生物量达到29.5g·L-1,苏氨酸的质量浓度达到118.9g·L-1,而乙酸质量浓度下降到0.8g·L-1,副产的其他氨基酸也大大降低。通过代谢流分析表明,在发酵后期的一个振荡周期(30h至31h)内,与非振荡组相比,HMP途径的代谢流量由6.5提高至95.88,CO2固定反应代谢流量由45.1提高至86.1,TCA循环相对代谢流量从1.86提高至17.78,从而导致苏氨酸对葡萄糖的质量转化率从30.0%增加至57.0%。溶氧强制振荡条件下的苏氨酸发酵液中各种副产物更少,更适合今后的大规模工业化生产。     

柠檬酸钠对肌苷发酵过程代谢流分布的调节

基于物料的质量守恒定律和中间代谢物的拟稳态假设,定量研究了柠檬酸钠对肌苷发酵过程不同时段代谢流分布的影响.结果表明,添加的柠檬酸钠能够抑制存在于EMP途径和TCA循环之间的“碳源溢流”.在24 h以后, EMP途径的代谢通量平均降低33％,HMP途径通量平均增加76％,肌苷合成途径通量平均增加77％,最终产苷由17.44 g•L^-1提高到24 g•L^-1, 增幅达37.6％.     

肺炎克雷伯氏菌生物合成1,3-丙二醇的副产物调控研究

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955为原始菌株,利用代谢工程手段对K.pneumoniae生物合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的副产物进行调控.通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到83.8 g·L-1,生产强度提至2.79 g·L-1·h-1;进一步结合乙酸吸收途径强化,有效解除了乙酸溢流现象,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到94.9g·L-1,生产强度提至3.16 g·L-1·h-1.研究表明,通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因结合乙酸吸收途径强化能够促进1,3-PD的合成,减少副产物的产生,提高K.pneu-moniae 代谢甘油合成1,3-PD的产量和生产强度.     

谷氨酸棒杆菌生物合成L-鸟氨酸的代谢流分析

应用代谢流平衡模型,通过物料衡算和Matlab线性规划的方法得到谷氨酸棒杆菌1009生物合成L-鸟氨酸的代谢流分布与理想代谢流分布.结果表明：在分批培养条件下,生物合成L-鸟氨酸的过程中,有58.6%的C架进入糖酵解途径,41.4%的C架进入戊糖磷酸途径,L-鸟氨酸的产量达到理论最大产率的65.4%;与理论值相比,应降低三羧酸循环的代谢流,同时减少副产物氨基酸和有机酸的生成.     

细胞生长、葡萄糖代谢及副产物重新利用对法夫酵母虾青素合成的影响分析

以两株产虾青素法夫酵母菌株为研究对象,分别在不同摇床转速、初始葡萄糖浓度、乙醇的存在与否等培养条件下,考察葡萄糖浓度、添加乙醇及溶氧状况对法夫酵母细胞生长、代谢副产物产生的影响及其与虾青素合成之间的关系,进一步阐明法夫酵母虾青素合成的机理。实验结果表明:法夫酵母JMU-VDL668菌株的生长速率、葡萄糖代谢速率和乙醇积累量均高于法夫酵母JMU-MVP14菌株,但前者的虾青素合成速率却远低于后者;当发酵液中的葡萄糖含量降低时,酵母细胞对糖代谢副产物进行二次利用,导致有利于虾青素合成的情况出现,虾青素产量得到进一步提高;在初始培养基中添加1 g?L?1乙醇能够在一定程度上促进虾青素的合成。     

抗生素AGPM生物合成的代谢调控研究

探讨了葡萄糖、铵离子及磷酸盐对抗生素AGPM生物合成的调控作用和机理。结果表明当葡萄糖、铵离子和磷酸盐浓度分别大于20 gL-1、20mmolL-1和25mmolL-1时,对抗生素AGPM合成均产生抑制作用。加入葡萄糖衍生物进一步证明葡萄糖的调控作用主要是通过其磷酸化过程来实现的;而对比分析不同铵离子浓度下细胞内酶活力则发现铵离子抑制糖代谢中的EMP途径和HMP途径有关酶,却刺激TCA循环关键酶;若培养基存在高浓度的磷酸盐时,胞内的6-磷酸葡萄糖会大量积累,说明糖进一步代谢受阻从而抑制抗生素合成。上述结果表明抗生素AGPM形成与营养组分浓度密切相关,而葡萄糖、铵离子和磷酸盐对其合成的调控主要是通过调节初级代谢控制抗生素合成前体浓度来达到调控目的的。     

核酸疫苗载体pVAX-44质粒高拷贝研究

研究了质粒复制的前体物质、蛋白质合成抑制剂及金属离子对核酸疫苗载体pVAX-44质粒拷贝数的影响.结果表明,在改良的LB培养基中分别添加谷氨酰胺、甘氨酸、天门冬氨酸和Fe3 时,单位菌体质粒含量分别达到5.88 mg·g-1、7.15 mg·g-1、5.93 mg·g-1、7.38 mg·g-1,同时添加这几种物质时,质粒拷贝数可以得到进一步扩增.均匀设计实验结果表明,改良的LB培养基中含有1.6 g·L-1甘氨酸、1.0 g·L-1天门冬氨酸、0.2 g·L-1谷氨酰胺、0.4 mmol·L-1 Fe3 时,单位菌体质粒含量可达到9.11 mg·g-1,明显高于单独添加这几种物质时的质粒拷贝数.在此基础上加入0.1 g·L-1链霉素抑制蛋白质合成,单位菌体质粒含量可达到9.53 mg·g-1,较对照提高了56.25%.     

葡萄糖浓度对杂交瘤细胞代谢通量分布的影响

将代谢工程理论应用于动物细胞的流加培养过程。通过构建代谢网络模型，研究了杂交瘤细胞从动态到拟稳态过程中物质和能量代谢通量的时间分布图。结果表明：当葡萄糖浓度较高时，葡萄糖在乳酸生成途径和TCA循环的代谢通量分配比例分别为90%和10%，ATP生成的比例分别为20%和60%，说明葡萄糖大部分经糖酵解途径生成乳酸，而进入TCA循环的少量部分则提供大部分的能量生成。当葡萄糖浓度降至其限制细胞生长的浓度时，进入TCA循环的葡萄糖比例逐步提高到100%，葡萄糖的氧化程度从0. 6 mmol·mmol^-1增至4. 52 mmol·mmol^-1，说明葡萄糖代谢逐渐从乳酸生成途径迁移到TCA循环，从无氧代谢逐渐转移到有氧代谢。     

金色链霉菌碳代谢流量变化特性的研究

建立简化的金色链霉菌代谢网络模型,根据其在复合培养基上的代谢特性,用优化手段求解细胞内碳代谢网络流量。根据不同时期金色链霉菌细胞内碳代谢流的分布,分析金色链霉菌生长代谢过程的碳代谢特性。研究表明, 在对数生长期,碳在EMP途径的通量为0.701mmolg-1h-1,占66.6%,进入HMS途径的流量为0.353mmolg-1h-1,占总碳消耗量的33.4%;在产物合成期,进入EMP途径的代谢流量降至0.382mmolg-1h-1,占进入细胞总碳流量的的51.6%;进入HMS途径的碳为0.358mmolg-1h-1,占48.4%。磷酸己糖旁路HMS通量对金霉素的合成起重要的调节作用, 添加磷酸盐和芳香性氨基酸抑制HMS途径的碳代谢通量,金霉素合成量分别降低50%以上。     

培养基组分对hCG核酸疫苗质粒拷贝数的影响

研究了培养基组分对hCG核酸疫苗质粒拷贝数的影响.结果表明,复合培养基比合成培养基更利于hCG核酸疫苗质粒DNA的生产.通过均匀设计实验确定,当培养基中含有胰蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出粉8 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、甘油10 g·L-1、KH2PO40.37 g·L-1、 K2HPO4 2.01 g·L-1时,单位菌体质粒含量可达6.68 mg·g-1;在此基础上添加乙酸2.0 g·L-1、谷氨酰胺1.2 g·L-1、甘氨酸1.0 g·L-1、天门冬氨酸0.4 g·L-1,可使质粒拷贝数进一步扩增,单位菌体质粒含量可达9.32 mg·g-1,为LB培养基的5.12倍.     

动态转录调控微生物代谢途径研究进展

传统的微生物代谢工程主要是通过过表达或敲除关键基因来实现产物产量最大化,但会造成代谢流失衡,生产效能降低。而对微生物代谢途径进行动态调控可维持细胞生长,平衡代谢流,提高生产效率。本文根据信号分子的来源不同,将微生物在转录水平的动态调控分为两种：一种是在光、温度、化学诱导剂的外源信号刺激下,利用响应该信号的启动子等元件调控下游代谢途径的人工诱导动态调控;另一种为在胞内代谢物水平或细胞密度改变的内源信号感应下,利用启动子、转录因子、核糖核酸开关调节关键基因的细胞自主诱导动态调控。本文同时介绍了转录水平动态调控策略在微生物代谢工程中的应用实例,以期对代谢途径的多个基因实现连续动态表达以及适配表达,有效提高目标产物的产量。     

葡萄糖和木糖双底物生物合成2,3-丁二醇的条件优化

针对利用葡萄糖和木糖合成2,3-丁二醇的Klebsiella pneumoniae XJ-Li菌,优化培养基组成与发酵条件,围绕五、六碳糖共代谢的特点,探讨简单可行的代谢调控方法. 结果表明,60 g/L葡萄糖和40 g/L木糖为碳源,5.75 g/L NH4H2PO4为氮源,pH值维持在5.5,培养温度38℃, 2,3-丁二醇浓度可达19.24 g/L. 确定了pH值调控和外源添加维生素C的调控方式,通过调节发酵过程中pH值于5.5左右,使2,3-丁二醇的产量提高了16.4%;添加60 mg/L维生素C调节培养基的氧化还原状态,可使2,3-丁二醇的产量提高44.3%,批式发酵48 h, 2,3-丁二醇终浓度可达33.47 g/L.     

基于关键节点代谢流重排提高酿酒酵母的香叶基香叶醇产量

香叶基香叶醇(geranylgeraniol,GGOH)是生产香料、药物、维生素A和E的重要中间体,其生物活性构型为(E,E,E)-GGOH。为了提高酿酒酵母的(E,E,E)-GGOH产量,在表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶-法尼基焦磷酸合酶融合酶(BTS1-DPP1)和香叶基香叶基焦磷酸合酶-二酰基甘油二磷酸磷酸酶融合酶(BTS1-ERG20)的初始菌株(产34.85mg?L~(-1)GGOH)的基础上,本实验进一步利用代谢工程的手段对法尼基焦磷酸(FPP)代谢节点处进行代谢流重排。一方面,过表达了来源于红法夫酵母的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶突变体(Crt E03M),增加了前体物质GGPP的供应,从而将GGOH产量提高了1.6倍,达到56.04mg?L~(-1);另一方面,利用葡萄糖诱导性弱启动子PHXT1对竞争支路关键酶角鲨烯合酶(ERG9)进行下调,从而使GGOH产量提高4.5倍,达到156mg?L~(-1)。同时,通过敲除GAL80基因构建了葡萄糖调控的GAL体系,用以控制GGOH的合成,与PHXT1控制的角鲨烯合成支路一起,构成了顺序表达体系,最终,以十二烷为有机相,在摇瓶中进行两相发酵,培养72 h后获得GGOH产量183.07mg?L~(-1),与初始菌株相比提高了5倍。本工作对其他FPP下游途径的代谢调控具有借鉴意义。     

重组大肠杆菌合成蛋氨酸的代谢途径优化

L-蛋氨酸(methionine)是一种具有重要生理学功能及应用价值的含硫氨基酸。为了提高蛋氨酸的生物合成,通过敲除蛋氨酸合成的阻遏蛋白基因metJ及苏氨酸合成途径中编码高丝氨酸激酶基因thrB,部分解除了蛋氨酸合成的反馈阻遏,使蛋氨酸积累达到了0.18 g×L~(-1)。根据已知的与蛋氨酸积累有关的功能基因,采用敲除及过表达的技术,从蛋氨酸代谢网络及转运等角度综合优化了蛋氨酸的合成代谢,考察了蛋氨酸合成关键反应、蛋氨酸转运,以及与蛋氨酸合成途径密切相关的苏氨酸合成途径、蛋氨酸循环途径等不同因素对蛋氨酸合成的影响。优化了大肠杆菌蛋氨酸代谢网络途径,强化蛋氨酸向胞外的转运,蛋氨酸产量达到了0.40 g×L~(-1),为进一步提高蛋氨酸合成效率奠定了基础。     

不同碳源对水产养殖固体颗粒物生物絮凝效果的比较

通过添加葡萄糖和醋酸钠2种碳源进行生物絮凝的培养,比较了2种碳源生物絮凝效果的差异.试验设添加葡萄糖碳源,添加醋酸钠碳源和不添加碳源3个反应器,分别将10 g饲料溶解于10L水中,培养过程中添加碳源反应器维持碳氮比大于10.经过33 d培养,葡萄糖碳源反应器絮体蛋白含量为30.4％,累积氨氮质量浓度在第5天达到最大值104.25 mg·L-1.醋酸钠碳源反应器絮体蛋白含量为34.6％,累积氨氮质量浓度在第6天达到最大值1 12.15 mg·L-1.无添加碳源反应器絮体蛋白含量为26.3％,累积氨氮质量浓度在第7天达到最大值117.89 mg·L-1.试验表明葡萄糖碳源生物絮凝反应器对水质的处理效果要优于醋酸钠,但在形成絮体的蛋白质含量上要小于醋酸钠.     

镁铝吸磷剂的吸附性能及应用研究

以铝盐、镁盐为原料制备了吸磷剂,通过静态吸附试验研究了不同合成条件、不同配方对除磷效果的影响,筛选出吸附效果最佳的吸磷剂。结果表明：PAM和适当的Fe3+添加能够促进磷的吸附,CO32-的引入则会降低吸磷效果;吸磷剂的合成条件以粒径60目和焙烧温度350℃为宜。筛选出最佳吸磷剂MAF-P-60m-350°,在投加量为1.8 g·L-1、初始浓度为15 mg·L-1时,对磷的最大吸附量为7.98 mg·g-1,磷的去除率可达95.76%。同时应用于农村一体化污水处理设备时,除磷剂吨水处理成本约为0.6元/吨水。     

玉米浆对大肠杆菌JH-B22发酵产L-丙氨酸的影响

为了进一步降低L-丙氨酸的生产成本,以大肠杆菌JH-B22为发酵菌株,以玉米浆为氮源、葡萄糖结晶废糖液为碳源进行L-丙氨酸的发酵。结果表明,发酵培养基中玉米浆添加量为20g·L~(-1)较为适宜。在玉米浆发酵培养基中进行L-丙氨酸的发酵,L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为54.30g·L~(-1)和90.5%;其L-丙氨酸产量略低于无机盐发酵培养基的56.12g·L~(-1)和LB发酵培养基的56.48g·L~(-1),但玉米浆发酵培养基具有配制更简单、无需额外添加无机盐或者成本较高的酵母粉等优点,可作为L-丙氨酸发酵生产的不错选择。