烟草高亲和硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.5的克隆及表达模式分析

【背景和目的】高亲和硝酸盐转运蛋白NRT2家族基因在植物硝酸盐吸收转运和再利用过程中发挥重要作用,为探索烟草NRT2家族基因NtNRT2.5对烟草氮素调控的作用。【方法】从烟草烤烟品种K326中克隆得到高亲和硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.5,进行生物信息和表达模式分析,创制NtNRT2.5启动子融合GUS报告基因的K326转基因烟草材料,进行GUS组织化学染色。【结果】NtNRT2.5基因的全长ORF为1509 bp,编码502个氨基酸,属于稳定性疏水蛋白,其蛋白跨膜结构域具有NRT2家族结构特征;烟草NtNRT2.5蛋白与拟南芥AtNRT2.5蛋白亲缘关系最近,功能相似;该基因启动子包含多种激素和胁迫响应元件;NtNRT2.5蛋白定位于细胞质膜;NtNRT2.5基因在烟草各组织都有表达,在下部叶中表达最强,且受低氮诱导表达增强,GUS组织染色结果表明,正常供氮和低氮条件下,在转基因烟草的根（中轴）和下部叶片（叶脉）中都检测到了GUS报告基因,均能显蓝色,且低氮条件下表达更加强烈,蓝色更深。【结论】烟草NtNRT2.5是高亲和硝酸盐转运蛋白的编码基因,该基因受低氮诱导表达增强,可能参...     

烟草硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.4的克隆及表达分析

植物NRT2基因家族(高亲和硝酸盐转运蛋白基因)在植物吸收和转运硝酸盐过程中发挥重要作用。本研究根据NRT2基因家族的保守序列设计兼并引物,扩增出一条821bp序列,以此序列为信息探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从烟草中克隆获得一个包含1593bp开放阅读框、编码530个氨基酸的c DNA序列,命名为Nt NRT2.4。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质具有NRT家族的共有结构特征,与烟草已发现的三个本家族基因同源性达到77.54%,与拟南芥NRT2家族基因同源性达到81.63%,其启动子中包含多个与硝酸盐、光照及根系特异表达相关的元件;组织特异表达分析结果显示,烟草Nt NRT2.4基因的组织表达差异较大,在根部的表达量较高,在叶片和茎部的表达量低;不同氮素形态、光照和蔗糖处理下的基因表达分析结果表明,硝态氮、光照和蔗糖处理诱导Nt NRT2.4表达,而铵态氮抑制其表达。     

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.7基因的克隆、亚细胞定位及表达模式分析

为研究硝酸转运蛋白(Nitrate transporter, NRT)在烟草吸收和转运硝酸盐中的作用,以烟草K326的cDNA为模板,克隆了一个全长1 839 bp、编码612个氨基酸的硝酸盐转运蛋白基因,命名为NtNRT1.7。生物信息学分析表明烟草NtNRT1.7具有典型跨膜结构域。同源性分析结果显示,NtNRT1.7与拟南芥AtNRT1.7的同源性达57.23%。亚细胞定位结果表明该蛋白定位在细胞膜上,是一个典型的膜蛋白。启动子分析和不同胁迫处理的qRT-PCR结果显示,NtNRT1.7主要在成熟叶中高表达,并受低氮诱导抑制表达,受干旱、低温、高盐等胁迫诱导增强表达,表明NtNRT1.7基因可能参与非生物胁迫条件下硝酸盐的再利用。      

过表达TaGS1/TaGS2对烟草氮素吸收的影响

  目的  为揭示小麦氮素同化关键酶谷氨酰胺合成酶（TaGS1/TaGS2）在烟草中过表达对烟草氮素吸收同化能力的影响及其机制。  方法  以烟草栽培品种K326为对照,测定分析过表达TaGS1/TaGS2烟草的生长及氮代谢指标;利用转录组结合进化树分析,确定烟草硝酸转运蛋白家族（NtNRT/NPF）及其表达水平。  结果  过表达TaGS1/TaGS2烟草根系发达、叶片变大,氮素吸收同化积累显著升高;在烟草中鉴定到36个NtNRT/NPF家族基因;过表达TaGS1/TaGS2引起其中28个NtNRT/NPF家族基因表达变化,与qRT-PCR结果一致。  结论  过表达TaGS1/TaGS2可能通过提高NtNPF6.3、NtNRT3.1、NtNPF7.3等NtNRT/NPF家族基因表达,促进烟草氮素吸收、同化与积累,为烟草生长发育提供充足氮源。      

不同小白菜品种硝酸盐含量、氮代谢关键酶活性及NRT1表达和亚细胞定位

采用液体培养实验研究了不同硝铵比（c（NO3 － ）∶c（NH4 ＋）分别为50∶50、75∶25和100∶0）对低硝酸盐富 集品种‘香港特选奶白菜’和高硝酸盐富集品种‘揭农四号春白菜’硝酸盐含量、氮代谢关键酶活性的影响,并 探讨了两个品种小白菜硝酸盐转运蛋白基因的表达和亚细胞定位。结果表明：‘香港特选奶白菜’和‘揭农四号春 白菜’在硝铵比100∶0处理中,叶硝酸盐含量分别较硝铵比50∶50处理增加了13.2%和30.4%,叶柄硝酸盐含量增加 了14.3%和4.9%。随着硝铵比的增加,小白菜叶片硝酸还原酶、谷氨酸合成酶活力呈降低趋势,亚硝酸还原酶活力 呈上升趋势,谷氨酸脱氢酶活力呈先增加后降低趋势,且两个小白菜品种之间差异显著。低亲和硝酸盐转运蛋白 （nitrate transporter,NRT）1基因NRT1在两个小白菜品种中均显著表达,且高富集硝酸盐品种“揭农四号春白菜” 的表达量显著高于低富集硝酸盐品种‘香港特选奶白菜’的表达量。NRT1是一个定位于细胞膜上的低亲和NRT。     

普通烟草NtIAA13b基因的克隆及功能分析

为探究生长素诱导相关基因NtIAA13在烟草钾吸收与利用中的作用,以烟草K326的cDNA为模板,克隆了一个全长879 bp,编码292个氨基酸的基因,并将该基因命名为NtIAA13b。采用qRT-PCR和亚细胞定位等生物技术对NtIAA13b基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性进行分析,通过转基因技术获得NtIAA13b基因过量表达株系并验证其生理功能。结果表明,NtIAA13b基因所编码的蛋白质相对分子质量为31.71 kD,理论等电点（pI）为6.48。NtIAA13b基因的启动子区包含生长素响应元件TGA-element、赤霉素响应元件P-box和参与厌氧诱导的调控元件ARE等。亚细胞定位的结果显示,该蛋白定位于细胞核。系统进化树结果表明,NtIAA13b和番茄SlIAA13亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,NtIAA13b基因在根中的表达水平最高,其次为茎,叶中表达水平最低。在正常供钾条件下,过量表达株系叶片的钾含量极显著增加。NtIAA13b基因与烟草响应低钾胁迫有关,可能参与了烟草钾的吸收与利用。     

NtNramp1基因参与不同镉积累基因型烟草品种镉积累差异的功能解析

【目的】探究不同品种烟草镉积累差异的分子机制。【方法】采用同源克隆方法从烟草不同镉积累基因型品种中克隆拟南芥At Nramp1同源基因Nt Nramp1;应用生物信息学方法分析烟草不同镉积累基因型品种中Nt Nramp1基因序列差异;通过酵母异源表达系统研究烟草不同镉积累基因型品种的Nt Nramp1对镉的转运活性差异。【结果】金英和Komotini Basma两个烟草品种对镉的积累存在显著差异;从镉积累显著差异的两个烟草品种中克隆到的Nt Nramp1基因(分别命名为Nt Nramp1a和Nt Nramp1b)编码区存在57个单碱基差异,其中Nt Nramp1a 1305位碱基变异(GA)导致所编码蛋白比Nt Nramp1b编码蛋白缺少C端两次跨膜;酵母异源表达结果表明来自低镉含量品种金英的Nt Nramp1a转运镉的活性比来自高镉含量品种Komotini Basma的Nt Nramp1b转运镉活性显著降低。【结论】金英和Komotini Basma两个烟草品种中Nt Nramp1蛋白活性差异是导致两烟草品种镉积累差异的重要原因。     

不同基因型烟草对氮素营养响应的差异研究

采用水培盆栽试验,研究了氮素营养对不同基因型烟草幼苗生长的影响.结果表明,不同基因型烟草对氮素营养的响应有明显差异,其硝酸盐还原酶活性、叶绿素含量、根系总吸收面积、氮含量均与氮浓度呈显著或极显著相关.不同基因型间硝酸盐还原酶活性差异显著,其中不耐氮肥基因型8136、红花大金元的硝酸盐还原酶活性明显高于其它品种,其叶绿素含量、根系活力及氮含量也高于其它品种,但其生物量随氮浓度的升高而降低;而较耐氮肥的基因型中烟90、KY17则与之相反.     

NtLTP2基因在烟草根系发育中的功能分析

为阐明烟草NtLTP2基因在烟草生长发育中的功能，以云烟87为试验材料，克隆了NtLTP2基因的编码区和启动子序列，分别对其进行生物信息学预测、启动子组织驱动特性分析，以及基因功能研究。结果表明NtLTP2基因编码区全长294 bp，编码97个氨基酸；NtLTP2具备nsLTP2和AAI-LTSS超家族保守域，蛋白质三级结构包含1个由4个α-螺旋组成的脂质疏水腔。烟草NtLTP2为根部优势表达基因，其启动子能够驱动下游基因在烟草根部特异表达。NtLTP2过表达烟草株系的侧根数目约为对照的2倍，根系的总长、总表面积和总体积均显著增加，并且地上部分的生长发育明显优于对照。     

烟草NtWRKY71基因克隆与表达分析

【背景和目的】WRKY转录因子作为一类植物特有蛋白，不仅参与植物抗病、抗逆等防御反应，而且在植物分枝发育过程中发挥重要作用。为鉴定烟草分枝发育相关的WRKY转录因子。【方法】以拟南芥分枝发育相关转录因子AtWRKY71序列为参考，在烟草基因组中进行鉴定和克隆。利用生物信息学方法分析烟草NtWRKY71理化性质和进化关系。通过qPCR和芯片表达谱分析了NtWRKY71时空表达特征和激素诱导表达模式，利用本氏烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位分析。【结果】烟草NtWRKY71基因的蛋白编码序列为930 bp，编码一个由309个氨基酸组成的WRKY蛋白。烟草NtWRKY71含有保守的WRKY蛋白结构域。进化分析显示NtWRKY71与野生烟草WRKY71、土豆WRKY71以及拟南芥WRKY71进化关系较近。基因表达分析表明，NtWRKY71在雄蕊、雌蕊以及根中大量表达；另外，NtWRKY71受赤霉素、生长素和水杨酸的诱导上调表达。亚细胞定位实验表明，NtWRKY71定位在细胞核中。【结论】烟草NtWRKY71为拟南芥分枝调控基因AtWRKY71的同源基因，其表达受到多种激素的调控。研究结果为深入解...     

普通烟草生长素抑制因子NtIAA17的克隆与功能分析

  背景和目的  盐胁迫会抑制作物的生长发育, 从而影响作物的产量和品质。生长素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)蛋白是响应生长素信号的关键因子, 参与调控植物的生长发育和响应非生物胁迫。  方法  为了研究烟草生长素反应基因NtIAA17在烟草生长发育过程中的功能, 以烟草K326为试验材料, 通过克隆获得烟草NtIAA17基因, 利用生物信息学分析其序列特征, qRTPCR技术分析NtIAA17在烟草不同组织及盐胁迫处理0~12 h的表达模式, 利用转基因技术获得过表达NtIAA17-OX(NtIAA17-overexpression)转基因烟草, 对其进行响应盐胁迫的功能鉴定。  结果  NtIAA17基因片段为624 bp, 编码207个氨基酸; 相对分子质量为23.07 kD, 理论等电点为8.24, 该基因启动子区含有顺式作用元件与激素及胁迫相关; 具有Aux/IAA家族蛋白的四个结构域(I-IV)和保守序列。NtIAA17基因与菠菜生长素抑制基因MoIAA13亲缘关系最近; 亚细胞定位分析表明, NtIAA17蛋白是核定位蛋白。qRT-PCR结果表明, NtIAA17基因在茎和老叶中高表达, 盐胁迫2 h时表达量最高。在盐胁迫条件下, NtIAA17-OX转基因烟草与野生型相比, 生物量显著增加, 脯氨酸含量积累增加, 而MDA含量减少, 抗氧化酶基因NtSOD、NtPOD表达量增加。  结论  NtIAA17基因可以响应盐胁迫信号, 通过提高转基因烟草的抗氧化性来抵御盐胁迫带来的伤害, 增加植株的生物量; 本研究为后续耐盐胁迫分子育种提供候选基因和理论依据。      

烟草HQT基因超量表达对次生代谢物质一咖啡酰奎尼酸和黄酮醇合成的影响

  背景和目的  一咖啡酰奎尼酸（CQAs）和黄酮醇是植物重要的苯丙烷类次生代谢物质,对人体健康有益,然而在烟叶中含量甚微。  方法  NtHQT是烟草中调控一咖啡酰奎尼酸合成最后一步的一种酰基转移酶,为验证NtHQT是否参与黄酮醇的合成,本研究构建了pCXSN::NtHQT超量表达载体,转化野生烟草三生烟。  结果  转基因烟叶中一咖啡酰奎尼酸的含量最高可提高10.34倍,芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高可分别提高17.83和16.97倍,而生长表型与野生型烟草没有明显差异。  结论  NtHQT基因在不影响烟草的生长发育的前提下,不仅参与调控一咖啡酰奎尼酸的合成,也具有正向调控黄酮醇的生物合成的功能,提高烟叶中芦丁和山奈酚芸香糖苷含量。      

冬虫夏草菌株发酵对非主料区烟叶感官品质和化学成分的影响

[目的]为提升非主料区宜宾烟叶品质和可用性,采用冬虫夏草菌株发酵烟叶并研究发酵对烟叶感官品质和化学成分的影响.[方法]对发酵过程样品进行感官质量评价并测定了常规化学物质和挥发性成分,采用偏最小二乘法和主成分分析法研究了发酵对烟叶感官品质和化学成分的影响.[结果]经过冬虫夏草菌株发酵后的宜宾烟叶,感官质量明显提升,发酵第...     

硝态铵态氮比例对不同氮效率烟草苗期氮素吸收及利用的影响

【目的】为明确最有利于烤烟和白肋烟氮素利用的氮素形态配比。【方法】采用盆栽的方法,以烤烟品种中烟100和白肋烟品种TN90为材料,设置5个硝态铵态氮比例(T1:NO₃^-:NH₄⁺=100:0;T2:NO₃^-:NH₄⁺=75:25;T3:NO₃^-:NH₄⁺=50:50;T4:NO₃^-:NH₄⁺=25:75;T5:NO₃^-:NH₄⁺=0:100),测定各处理的生物量、色素含量、硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)活性、NH₄⁺-N含...     

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

【目的】探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。【方法】以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。【结果】（1）共获得6株T0代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T1代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T1代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。【结论】定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。     

生物炭与化肥氮配施对土壤氮素及烤烟利用的影响

  目的  为探讨施用生物炭对土壤氮素及烤烟对氮素利用的影响。  方法  2015-2016年在河南省方城县金叶园大田条件下,设置了添加生物炭后不同氮水平,研究对土壤硝态氮、铵态氮、碱解氮以及烤烟对氮素吸收积累的影响。  结果  在烟株生育期内,添加生物炭后显著提高了土壤硝态氮含量。2015年硝态氮含量最高达到铵态氮含量的15.72倍,2016年为34.56倍;2016年提高无机氮含量达6.70%~52.47%;添加生物炭对土壤碱解氮含量在烤烟生长前期有一定的提高作用,而在烟株打顶后有效降低了其含量,有利于顺应土壤供氮与烤烟需要适时落黄成熟规律。施加生物炭后,烤烟氮素积累速率前期较高,后期下降。连续施用2年后,氮素利用率可高达49.14%和47.62%。  结论  生物炭与氮肥配施,提高了土壤氮素含量,增施生物炭减少15%化肥氮仍能提高烤烟氮素利用,且连续施用对氮素固持和提高烤烟利用率效果明显。      

VIGS诱导GS同工酶基因沉默对烤烟氮代谢的影响

【背景和目的】谷氨酰胺合成酶（GS）是烤烟氮代谢的关键酶,为探究沉默GS同工酶基因对烤烟氮代谢的影响。【方法】采用病毒诱导基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术构建GS同工酶基因（NtGS1、NtGS2）瞬时沉默表达载体,测定了烤烟品种中烟100叶片经VIGS处理10 d,20 d和30 d的NtGS1-1、NtGS1-2、NtGS2相对基因表达量和谷氨酰胺合成酶（GS）、硝酸还原酶（NR）活性以及叶片可溶性蛋白、总氮、烟碱含量和烟株生物量。【结果】沉默NtGS1基因的处理对NtGS1-1沉默效率最高为50.4%,对NtGS1-2沉默效率最高为56%,沉默NtGS1和NtGS2基因的处理对NtGS2沉默效率最高为54.9%;沉默NtGS1和NtGS2的烟株叶片重、GS、NR活性、可溶性蛋白、总氮、烟碱含量都显著低于对照。【结论】本研究建立的VIGS体系有效下调了GS同工酶基因的表达,同时沉默NtGS1和NtGS2(TRV::GS1::GS2)可抑制叶片氮素同化利用,降低氮代谢关键酶活性与含氮化合物含量。     

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。