烟草PPO基因家族鉴定与不同成熟度烟叶烘烤过程中PPO活性分析

【背景与目的】多酚氧化酶（PPO）参与的棕色化反应是生产高品质烟草产品的关键环节，为了明确烟草中PPO基因的结构与功能。【方法】通过生物信息学的方法鉴定烟草PPO基因家族成员及其特征；利用qRT-PCR方法分析了翠碧一号上部4种成熟度烟叶（M1～M4）PPO基因的表达，并采用多酚氧化酶活性检测试剂盒测定烘烤过程中烟叶PPO酶活性变化。【结果】烟草基因组中共鉴定到12个NtPPO基因，大多数成员具有类似的基因结构、相近的蛋白长度和保守的蛋白结构域。系统进化分析将菠萝、高粱、番茄、马铃薯和烟草的PPO蛋白分为3个亚族，其中Ⅱ，Ⅲ亚族中均为双子叶植物的PPO成员。NtPPOs基因家族成员的表达量随着成熟度提高表现出不同的变化模式，大多数成员在过熟烟叶中表达量最低。烘烤过程中不同成熟度烟叶中PPO活性也存在明显差异，其中M2、M3和M4成熟期烟叶PPO活性呈现先下降后上升再下降的趋势，在45℃达到最大值，且M2>M3>M4。【结论】研究结果可为烟草PPO基因的功能研究、烟叶棕色化的调控和品种遗传改良奠定基础。     

钼对烤烟烘烤过程中酶促棕色化和烟叶质量的影响

采用大田试验,在贵州平塘、独山和福泉烟区缺钼土壤上进行烤烟叶面喷施钼肥试验,研究钼对烟叶烘烤前期抗坏血酸(AsA)含量、多酚氧化酶(PPO)活性和烤后烟叶质量的影响。结果表明,施钼能提高各试验点上部成熟烟叶AsA含量,且在烘烤前期(0～90 h内)烟叶AsA含量总体高于CK;使烟叶PPO活性明显降低,在烘烤前期(特别是0～42 h内)PPO活性明显低于CK;能改善烤后烟叶特别是上部叶化学成分的协调性;能提高烟叶含钼量以及烤后烟叶上等烟比例。     

钼对烤烟烘烤过程中酶促棕色化反应相关指标的影响

采用田间试验,对K326、云烟85、CB-1、红花大金元(红大)4个烤烟品种进行叶面喷施钼肥处理,研究了施钼对上部烟叶烘烤前期抗坏血酸(AsA)含量、多酚氧化酶(PPO)活性和烤后烟叶等级的影响。结果表明:在土壤缺钼(有效钼0.03 mg/kg)条件下,施钼的K326和云烟85品种成熟烟叶AsA含量提高,并且4个品种在烘烤前期(0～72 h内)烟叶AsA含量基本高于对照。施钼处理的K326、红大和CB-1成熟烟叶体内PPO活性明显降低,4个品种在烘烤前期(特别是48 h内)PPO活性基本低于对照;施钼的烤后上中等烟叶比例明显提高,杂色烟比例显著降低。     

打顶时期对不同烤烟品种烘烤特性的影响

通过测定烤烟烟叶烘烤特性的相关指标,研究了打顶时期对烘烤特性的影响及品种间的差异。结果表明,适当推迟打顶能促进烟叶烤前和烘烤过程中叶绿素和类胡萝卜素的降解,降低含水量,提高失水速率,使丙二醛含量上升和多酚氧化酶活性降低,使烤后烟叶黄烟比例上升。烟叶易烤性和耐烤性均增加。但打顶时间过晚,烟叶质体色素含量过低,失水和衰老速度过快,使烟叶变黄失调,易出现黑糟烟,对改善烘烤特性不利。品种的差异是影响烟叶烘烤特性和确定打顶时间的重要因素。     

特殊烟叶烘烤过程中生理生化变化及烤后质量特点

以正常烟叶为对照,对黑暴烟、黑胫病烟叶、叶斑病烟叶、病毒病烟叶等特殊烟叶烘烤过程中的生理生化指标及烤后烟叶质量进行了分析研究。结果表明,特殊烟叶烘烤前中期水分含量偏高或偏低;黑暴烟烘烤过程中叶绿素和类胡萝卜素含量都明显高于正常烟叶和其他特殊烟叶,类胡萝卜素/叶绿素（类叶比）变化较小,黑胫病、病毒病、叶斑病烟叶烘烤过程中类叶比的高峰值出现时间早于正常烟叶;烘烤前期特殊烟叶多酚氧化酶活性比正常烟叶高;特殊烟叶烤后碳水化合物含量低,含氮化合物含量高,评吸时香吃味变差、杂气和刺激性加重。     

烟叶烘烤中不同区段叶片含水量、色素和酶活性变化

为探索不同分割区段烟叶烘烤中主要生理变化趋势和差异,将烟叶去除主脉等分为叶基(T1)、叶中(T2)、叶尖(T3)3个区段,与整叶(CK)装在同一温湿度自控电热烤箱进行烘烤,测定不同处理叶片含水量、色素和主要酶活性变化差异。结果表明,不同区段处理含水量主要在42～47℃差异较大,42℃末为CKT1T2T3,47℃末为CKT2T3T1;叶绿素含量在开烤至47℃末T1较高;类胡萝卜素含量在开烤至42℃末T1较高;类叶比在47℃末差异最大,且T3T2CKT1;淀粉酶活性均在38℃末达到第1个峰值,且T3T2T1CK;在38～54℃末CK的多酚氧化酶(PPO)活性最大,T1、T2、T3间无明显差异;各处理过氧化物酶(POD)活性均在38℃末达到最高峰,CK、T2、T3较接近,T1最低。在烘烤过程中烟叶不同区段叶内含水量、色素、酶活性变化趋势大体相似,但在不同烘烤关键阶段存在一定差异,这为优化片烟烘烤工艺和提高烤后烟叶质量提供了理论依据。     

烤烟烘烤过程中品种间的生理生化反应差异研究

为摸清不同烤烟品种的烘烤特性,探讨烟叶烘烤过程中生理生化指标的变化,分别测定了红花大金元、中烟100、K326烘烤过程中关键温度点的色素含量、含水量以及多酚氧化酶活性。3个烤烟品种在变黄、失水以及酶活性上存在差异。红花大金元自由水散失慢,定色期束缚水散失较快,自由水束缚水比值高,多酚氧化酶活性强,叶绿素含量高且降解不彻底,影响烤后原烟的外观质量;K326烘烤过程失水快,自由水束缚水比值低,多酚氧化酶活性居中;中烟100烘烤过程变黄速度与失水速率协调,多酚氧化酶活性低,中上等烟比例和均价最高。     

多酚氧化酶抑制剂对烟叶质量的影响

为解决烟叶在调制过程中颜色过度转深问题,于烘烤前将l-半胱氨酸和硫脲两种多酚氧化酶抑制剂应用于烟叶,并对烤后烟叶的多酚含量、外观质量、评吸质量及烘烤过程中多酚氧化酶活性变化进行了分析.结果表明:烘烤前烟叶表面喷施浓度为4.0和8.0 mmol/L的l-半胱氨酸,烤后烟叶中总绿原酸含量和多酚总量明显增加,外观质量和评吸质量较对照有所改善,烘烤过程中多酚氧化酶的活性较对照有所降低.     

烟叶淀粉降解菌的筛选及其作用效果研究

为有效降解烟叶淀粉含量,提高烟叶品质和安全性,以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YA14经优化条件发酵后的菌液喷施至待烤鲜烟叶并室温下放置处理48 h,然后进行烘烤,分析喷施烟叶与对照烟叶烘烤过程中淀粉和蛋白质含量、相关酶活性及烤后烟叶常规化学成分、外观质量与感官质量的变化,并采用扩增子测序技术对烟叶微生物群落的变化进行了分析。结果表明,经优化条件发酵后,YA14菌株产淀粉酶活力达146.38 mg/(mg·min)。烘烤前喷施YA14菌液显著降低了烟叶的淀粉含量,降解率达37.17%,但对烟叶蛋白质没有明显降解作用。喷施YA14菌液能不同程度地提高烟叶过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和淀粉酶的活性,降低多酚氧化酶（PPO）、淀粉分支酶（SBE）及硝酸还原酶（NR）的活性。此外,喷施YA14菌液可以提高烟叶群落丰富度及物种多样性,有效提高了芽孢杆菌属（Bacillus）和曲霉属（Aspergillus）等优势菌群丰度,并降低了窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）和赤霉属（Gibberella）等菌群的相对丰度。施用YA14菌株后烤后烟叶化学成...     

密集烤房不同装烟方式对烟叶质量及效益的影响

为优化密集烤房装烟方式,充分发挥烤烟密集烘烤的优势,对散叶烘烤、烟夹持烟、烟竿编烟3种装烟方式烤后烟叶的外观质量、评吸质量、经济性状及烘烤能耗成本进行了比较研究。结果表明,烟夹持烟烤后烟叶橘黄烟比例比烟竿编烟烘烤高11.11%,散叶烘烤的杂色烟比例明显低于烟夹持烟和烟竿编烟;散叶烘烤和烟夹持烟烤后烟叶的评吸质量均优于烟竿编烟;散叶烘烤烟叶的中上等烟比例和均价最高;烟夹持烟烘烤的耗煤、耗电成本最低。综合烤后烟叶的经济性状和能耗成本,以烟夹持烟的效益最好。因此,在其他烘烤设施和烘烤技术配套的前提下,烟夹持烟可以替代传统的烟竿编烟;散叶烘烤是密集烤房装烟方式的发展方向之一。     

箱式密集烘烤过程中烟叶化学成分的变化动态及其对烤后烟质量的影响

[目的]探明箱式密集烘烤过程中烟叶化学成分的变化动态及对烤后烟质量的影响.[方法]研究烟夹和箱式两种装烟方式在烘烤过程中烟叶的含水量、色素含量、主要化学成分含量、香气成分含量变化及烤后烟质量.[结果]与烟夹密集烘烤相比,47℃前箱式密集烘烤烟叶失水速率较低,淀粉降解量及水溶性糖积累量较少,叶绿素降解速率较低,香气成分总...     

硝态铵态氮比例对不同氮效率烟草苗期氮素吸收及利用的影响

【目的】为明确最有利于烤烟和白肋烟氮素利用的氮素形态配比。【方法】采用盆栽的方法,以烤烟品种中烟100和白肋烟品种TN90为材料,设置5个硝态铵态氮比例(T1:NO₃^-:NH₄⁺=100:0;T2:NO₃^-:NH₄⁺=75:25;T3:NO₃^-:NH₄⁺=50:50;T4:NO₃^-:NH₄⁺=25:75;T5:NO₃^-:NH₄⁺=0:100),测定各处理的生物量、色素含量、硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)活性、NH₄⁺-N含...     

外源水杨酸对低温胁迫下低温敏感性不同的烤烟品种烟叶生理特性的影响

  目的  探究低温胁迫下外源水杨酸对低温敏感型不同烤烟品种叶片生理特性的影响,并筛选最佳外源水杨酸的缓解浓度。  方法  以低温不敏感型品种红花大金元及低温敏感型品种K326为材料,通过盆栽试验研究不同浓度外源水杨酸对4℃低温胁迫下红花大金元和K326叶片相对电导率（REC）、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量及多酚代谢的影响。  结果  低温胁迫下,2个低温敏感性不同的烤烟品种的相对电导率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均显著上升,其中,K326的丙二醛含量上升幅度远大于红花大金元,达94.07%;而3个抗氧化酶活性均被显著降低,K326的可溶性糖含量及总酚含量、红花大金元的可溶性蛋白含量均显著上升。施加外源水杨酸后,K326及红花大金元的叶片相对电导率及丙二醛含量均显著降低,而3个抗氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均显著上升,红花大金元的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量、K326的总酚含量均显著上升;当外源水杨酸浓度为50~100 mg/L时对各个指标的缓解效果较好。  结论  外源水杨酸浓度50 mg/L处理对红花大金元及K326的缓解效果均达到最佳。      

干旱胁迫后复水对烤烟生长及其生理特性的影响

  目的  为明确干旱胁迫后复水对烤烟生长及其生理基础的影响。  方法  采用盆栽试验方法,以耐旱型烤烟品种“豫烟6号”和水分敏感型“豫烟10号”为试验材料,设置正常供水、轻度干旱、中度干旱、轻度干旱后复水和中度干旱后复水5个处理,比较分析干旱胁迫后复水对烤烟生长及其生理特性的影响。  结果  （1）随着干旱的加剧,两个烤烟品种生长受到抑制,生理性能下降,株高、茎围、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积、有效叶片数、根系干重和单株干重均降低或显著降低,叶绿素含量、净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）、蒸腾速率（T_r）、PSII最大光能转化效率（F_v/F_m）、PSⅡ实际光化学效率（Φ_PSⅡ）和光化学淬灭系数（qP）均显著降低,而非光化学猝灭系数（NPQ）、胞间二氧化碳浓度（C_i）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性均显著增加;与正常供水相比,豫烟10号在干旱胁迫下各指标变化幅度大于豫烟6号,对干旱较敏感。（2）干旱胁迫后复水,与干旱处理结束时相比,两个烤烟品种生长得到明显恢复,光合作用增强,抗氧化系统平衡得到明显改善。豫烟10号在干旱胁迫后复水各指标变化幅度均大于豫烟6号,干旱胁迫后复水恢复较好。  结论  在干旱胁迫下,两个烤烟品种的生长和生理性能均受到不同程度的抑制,且均与正常供水处理间差异显著;复水后,两个烤烟品种的生长及其生理性能均得到不同程度的恢复,其多数指标均以中度干旱胁迫后复水处理恢复较好,且与正常供水处理无显著差异。      

喷施外源EBR和H2O2对低温胁迫烟苗恢复生长期生理特性的影响

  目的  探讨表油菜素内酯（EBR）和过氧化氢（H₂O₂）对低温胁迫后烟草幼苗生理和生长特性的影响。  方法  以烤烟品种K326为材料,研究低温胁迫后喷施外源表油菜素内酯（EBR,0.01 mg/L）和过氧化氢（H₂O₂,340 mg/L）对烤烟苗期抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、渗透调节物质、丙二醛（MDA）和生物量的影响。  结果  （1）烟草苗期低温胁迫（CK1）4 d与正常生长（CK2）烟株相比SOD活性降低,POD、CAT活性升高,MDA、可溶性糖和脯氨酸含量上升,可溶性蛋白含量下降,生物量降低;（2）低温胁迫结束后,喷施外源EBR（T1）和H₂O₂（T2）相比低温对照（CK1）,恢复生长12 d烟苗SOD、POD、CAT活性分别提高61.87%和47.37%、239.06%和193.11%、168.07%和139.63%,MDA含量分别降低60.00%和50.00%,渗透调节物质含量和生物量显著增加;（3）喷施外源EBR（T1）和H₂O₂（T2）与正常生长（CK2）烟株相比,在恢复生长8 d和12 d时SOD、POD、CAT活性与可溶性糖含量无显著差异,MDA含量降低,脯氨酸含量显著上升。  结论  喷施外源EBR（0.01 mg/L）和H₂O₂（340 mg/L）能加快低温胁迫后烤烟K326幼苗的生理和生长恢复进程。      

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

  目的  为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。  方法  从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。  结果  NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和NtMYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸（ABA）合成基因NtNCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。  结论  NtMYB68转录因子能抑制NtZEP和NtNCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。      

八大香型烤烟典型产地中部烟叶适宜复烤干燥温度研究

【目的】明确八大香型典型产地烤烟中部烟叶较适宜的复烤干燥温度范围。【方法】选取八大香型典型产地中部烟叶,在不同复烤干燥温度下对烟叶感官质量、风格特征进行评价。【结果】(1)清甜香型、清甜蜜甜香型和木香蜜甜香型中部烟叶适宜在70℃复烤干燥温度下加工;(2)蜜甜香型、醇甜香型和焦甜醇甜香型烟叶适宜在75℃复烤干燥温度下加工;(3)焦甜焦香型和焦香蜜甜香型烟叶适宜在75℃～80℃复烤干燥温度下加工。【结论】根据不同香型烤烟烟叶适宜的复烤干燥温度进行配方模块设计、配方模块复烤加工,可彰显烟叶香气风格特征,提升总体感官质量。     

烤烟不同成熟度上部叶中抗性淀粉与淀粉组分的变化及其与基因表达的关系

  目的  为研究烤烟上部叶在成熟后期及烘烤过程中淀粉组分和抗性淀粉含量的变化。  方法  以烤烟品种云烟87上部叶为试验材料,分析不同成熟度鲜烟叶及其在烘烤过程中淀粉组分和抗性淀粉含量的变化,阐明抗性淀粉和淀粉组分的相关性,通过实时定量PCR探究不同成熟度烟叶中淀粉合成相关基因的表达模式。  结果  （1）随烟叶不断成熟,淀粉粒数量迅速变多、体积增大,烟叶变黄时,叶绿体开始解体,淀粉粒逐渐降解。（2）不同成熟度鲜烟叶中直链淀粉含量与支链淀粉含量:欠熟 > 适熟 > 过熟,而抗性淀粉含量差异不大;在烟叶衰老过程中,支链淀粉迅速降解,而直链淀粉和抗性淀粉缓慢降解。（3）在烘烤过程中,淀粉降解主要集中在变黄期。烘烤结束后,烤烟中未降解的淀粉约50%为抗性淀粉。（4）淀粉合成基因葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶小亚基3（AGPS3）、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶大亚基（AGPL）、颗粒结合型淀粉合酶（GBSS）、可溶性淀粉合酶2（SS2）、1, 4-a-葡聚糖分支酶（SBE1）、2, 3淀粉分支酶2（SBE2）和异淀粉酶2（ISA2）在欠熟烟叶中的基因表达水平较高,随烟叶衰老表达水平下调,而异淀粉酶3（ISA3）的基因表达水平在烟叶衰老过程中持续上调。  结论  烤烟不同成熟度上部叶中存在抗性淀粉,烘烤过程的变黄期是烟叶内淀粉降解的主要时期,但大田期形成的抗性淀粉很难在烘烤过程中充分降解。因此,可以通过适当推迟烟叶采收,降低烤烟淀粉含量,从而提高上部叶可用性。      

基于三维点云的烤烟三维模型构建及株型分析

  目的  为了构建烟株的三维模型、提取烤烟株型信息。  方法  采用结构光扫描仪获取烤烟的三维点云数据,经过点云配准、点云去噪以及孔洞修补等步骤后构建了烤烟的三维模型,并对烤烟株型参数进行了误差估计。  结果  利用该方法构建的烤烟三维模型能够精确还原烤烟的形态结构,叶长、叶宽和株高的机器测量值和人工测量值拟合方程的R2均达0.8以上。  结论  基于三维点云构建的烤烟三维模型精度高,为烟草科研和烟叶生产提供了一种高精度的烤烟株型判别方法。      

大豆与海藻有机肥对烤烟生长和土壤细菌群落的影响

  目的  探究不同有机肥施用对烤烟生长和土壤细菌群落的影响。  方法  用烤烟品种中烟100进行田间试验, 比较分析了大豆和海藻有机肥不同施用量对烤烟生长发育以及烟叶中氮、磷、钾含量的影响, 并且从土壤理化性质以及土壤微生物群落结构的角度, 分析了施用两种有机肥对烟叶生长、土壤理化性质和土壤微生物群落结构的影响。  结果  (1) 与对照相比, 大豆和海藻有机肥的施用, 促进了团棵期和旺长期烟株的生长发育(450 kg/hm2处理最佳), 提高了土壤有机质和氮磷钾含量。(2)由16 S V3-V4区域扩增子测序可知, 有机肥的施入改变了土壤细菌群落的丰富度和多样性, Sphingomonas、Actinospica、Pseudonocardia等有益细菌丰度增加。(3)土壤细菌群落与土壤理化性质存在一定相关性, 其中土壤pH值、速效钾(AK)、硝态氮(NO₃--N)和铵态氮(NH₄+-N)是主要环境影响因子。  结论  大豆和海藻有机肥的施用改善了土壤理化性质, 并影响了土壤细菌群落丰富度和多样性, 促进了烟株生长发育。