扫描电镜显示细胞表面的分子标记

为了研究细胞表面特异蛋白质的分布,铁蛋白、乳胶颗粒、胶体金甚至病毒颗粒一度都曾作为扫描样品的标记物。但目前最有潜力并表现出巨大优越性的无疑是新近发展起来的胶体金标记技术。我们用直径20nm的蛋白A—胶体金和抗水泡性口炎病毒(vsv)表面膜蛋白(G蛋白)的抗体及抗辛德毕斯病毒(sbv)表面膜蛋白(E_1和E_2蛋白)的抗体,按常规免疫标记并经过我们实验室改进的方法,分别标记了VSV和sbv感染的BHK-21细胞或鸡胚成纤维细胞,经固定和临界点干燥后,镀以厚度约为50A的1金膜,在Hitachi S-570扫描电镜下观察。     

病毒感染单层细胞的免疫标记与断裂技术

用抗Sindbis病毒(SbV)囊膜蛋白E_1和E_2的抗体及抗Vesicular Stomatitis病毒(VSV)囊膜蛋白(G蛋白)的抗体分别对病毒感染的BHK-21细胞进行胶体金免疫标记,然后按冰冻蚀刻的制样程序制备铂-碳复型膜以研究病毒囊膜蛋白在细胞质膜上的定位与分布。本文扼要地介绍了这一技术的操作过程,同时,结合我们自己的工作对该技术的要点及其应用进行了讨论。     

辛德毕斯病毒囊膜蛋白的免疫标记

辛德毕斯病毒(Sindbis Virus,简称SbV)是最小的有囊膜的RNA病毒之一(图1),其囊幕含有二种病毒特异的囊膜蛋白(图1箭头)。病毒囊膜蛋白是在宿主细胞粗面内质网上合成的,经高尔基体加工后转运到细胞质膜上。研究SbV囊膜蛋白在细胞膜上的分布有助于进一步了解病毒的成熟与释放过程及其机制。我们曾参照P.Pinto da Silva的方法用抗病毒囊膜蛋白的抗体对SbV感染的细胞进行胶体金免疫标记,然后制备冰冻断裂复型样品,获得了宿主细胞质膜EF面复型与ES面的标记金颗粒的叠加图象(图2),进而我们探索了标记一复型技术和获得PF面复型与PS面标记金颗粒的叠加图象的方法,前者更有效地显示SbV囊膜蛋白在细胞质膜上的分布(图3),后者则可以把细胞内的免疫标记与冰冻蚀刻技术相结合,以对膜内微粒中的SbV囊膜蛋白进行定性定位的研究(图4),从而在一定程度上弥补了P.Pintoda Silva方法的不足。     

BHK21细胞的中间纤维体系

应用选择性系列抽提方法与整装细胞制备技术、DGD包埋—去包埋剂切片技术相结合,清晰的显示了BHK_(21)细胞中间纤维,其单丝直径为10nm。近核区的中间纤维呈致密交织的网络,胞质远侧区的中间纤维有规则的平行排列。免疫荧光与免疫胶体金标记实验说明,经上述选择性系列抽提后存留的胞质结构仅对波形蛋白(Vimentin)抗体呈阳性反应。最后用双向电泳技术分析了BHK_(21)细胞中间纤维波形蛋白的分子量为55KD。     

冰冻蚀刻胶体金标记技术

冰冻蚀刻技术主要的优越性之一是可以显示出镶嵌在细胞膜内的蛋白质颗粒,而对这些种类,数量繁多的膜内微粒的定性与定量研究,则是近几年刚刚建立的一个重要的电镜新技术。本实验用直径5nm的胶体金一羊抗兔抗体和直径20nm的胶体金一蛋白A的复合物,以及抗辛德毕斯病毒(sbv)表面糖蛋白E和抗sbv的抗体及抗水泡性口炎病毒(vsv),表面糖蛋白的抗体,分别标记了sbv或vsv感染的BHK—21单层细胞,经固定和甘油处理后,再把长有细胞单层的盖玻片小心裁成大小1～2mm的小块,在Balzars冰冻蚀刻仪中断裂、喷镀复型膜。仅用蒸馏水将复型膜连同细胞碎片漂起,即可捞在400目的载网上。     

银增感免疫电镜的效果观察

胶体金免疫民镜技术是利用抗原和抗体特异性结合，在电镜下检测与抗体结合电子密度高的胶体金，确定抗原位置。因此已成为研究细胞化学的重要技术，得到广泛应用。但被检的胶体金粒子直径一般在10nm左右，很难在低倍下、大视野观察不同细胞的标记情况，为此，增大胶体金颗粒十分必要。     

胶体金免疫电镜技术检测番茄环纹斑点病毒

本实验利用胶体金免疫电镜技术检测番茄环纹斑点病毒（ tomato zonate spot virus, TZSV）,分别以TZSV的N 蛋白多克隆抗体及TZSV的Gn蛋白多克隆抗体为一抗,然后以胶体金标记羊抗兔IgG?gold（10 nm）为二抗对病毒进行胶体金标记,电镜观察用TZSV Gn蛋白抗体标记的胶体金颗粒能很好地结合到病毒粒体上。结果表明该方法可以实现对TZSV更为准确可靠地检测。     

G—17胃泌素细胞的免疫电镜观察

本文用兔抗人胃泌素G—17抗体标记胃G—17胃泌素细胞,分泌颗粒多数含低或中度嗜锇性粒芯,葡萄球菌A蛋白胶体金(PAG)主要标记在此型颗粒上;少数粒芯呈高度嗜锇性,此型颗粒仅少数被PAG标记。并就此结果进行初步讨论。     

应用电镜原位分子杂交技术对腺病毒DNA在宿主细胞内进行定位

以Biotin标记的dATP(Bio-7-dATP)通过缺刻翻译(Nick Translation)制备腺病毒的基因组探针,建立了电镜原位杂交技术,并研究腺病毒感染的HeLa细胞内病毒DNA的分布。结果表明,免疫胶体金颗粒特异地标记在腺病毒感染的细胞核内,并且在核内呈区域性分布。整装抽提后的细胞原位杂交结果显示出,胶体金颗粒呈族状马串珠状结合在核骨架上,从而在形态学上证实了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系。     

应用免疫胶体金技术对核骨架-Lamina-中间纤维体系标记定性

用选择性系列抽提技术与整装制样方法相结合,清晰地显示了Hela细胞与BHK_(-21)细胞的核骨架—Lamina—中间纤维结构体系。在此基础上,用电镜免疫胶体金标记技术对这一精细结构体系的成份分别进行定性研究,实验结果说明:Hela细胞与BHK_(-21)细胞核骨架纤维均能被298KD的核骨架蛋白单抗—金颗粒标记,它们的Lamina均被LaminA单抗—金颗粒标记,Hela细胞的中间纤维既能被角蛋白单抗又能被波形蛋白单抗—金颗粒所标记,而BHk_(-21)细胞的中间纤维却只能被波形蛋白单抗—金颗粒标记,不能被角蛋白单抗—金颗粒标记,但BHK_(-21)细胞的Lamina却与角蛋白单抗有交叉反应。将核骨架—Lamina—中间纤维体系的精细结构与其蛋白成份的定性同时准确地显示出来,至今尚未见过报导。     

家蚕质多角体病毒RDRP的免疫电镜定位研究

以原核表达BmCPV RDRP重组蛋白为抗原制备的兔抗血清为一抗,直径15nm山羊抗兔IgG 胶体金为二抗。应用3%多聚甲醛 0 1%戊二醛混和固定液、K4M低温包埋剂和紫外光聚合制备的样品进行免疫电镜观察,结果感染BmCPV(C)病蚕的中肠柱状细胞中,游离和病毒多角体中BmCPV的病毒粒子均能结合胶体金颗粒,平均标记率为25%左右,认为BmCPV(C) RDRP基因编码的蛋白应为BmCPV病毒的结构蛋白,位于病毒的衣壳上。其中一抗的使用浓度为1∶200,二抗的使用浓度为1∶40,可以获得较好的免疫标记效果和较少的非特异性标记。     

中间纤维结构体系及其免疫胶体金标记定性

应用分级抽提方法~[1],结合整装细胞电镜技术(Whole mount ceu EM)、非树脂包埋——去包埋剂电镜技术(embedment—free EM)~[2]及扫描电镜技术对HeLa细胞和牛肾传代细胞的中间纤维体系进行了观察,同时还应用角蛋白(Keratin)单克隆抗体——胶体金免疫电镜技术对HeLa细胞的中间纤维进行了定性研究。中间纤维在整装细胞电镜、DGD(Diethylene Glycol Distearate)包埋——去包埋剂电镜及扫描电镜下,均呈致密网状,其单丝直径均约10nm,这说明中间纤维在非离子去垢剂如Triton x—100及(NH_4)_2SO_4溶液的分级提取过程中是稳定的;同时也可以观察到较粗的纤维,这显然是单丝聚合形成的束。     

细胞内病毒抗原定位的低温包埋及胶体金标记

本文报告使用低温包埋剂Lowicryl K4M对感染细胞进行低温包埋和制作超薄切片,用包被SPA或IgG的胶体金作为第二抗体,采用间接法对两种RNA病毒(脊髓灰质炎病毒和轮状病毒)和两种DNA病毒(单纯疱疹Ⅰ型病毒及SV_(40))在感染细胞中作了定位标记实验。将结果同常规环氧树脂Epon 812包埋的感染细胞包埋前穿透标记和包埋后超薄切片标记进行比较。常规包埋法对细胞超微结构保存良好,但由于高温聚合对病毒抗原活性破坏较大,不能获得理想的金标记结果。使用皂角甙(Saponin)改变细胞膜进行包埋前穿透标记,虽能获得特异性标记,但皂角甙对细胞膜结构破坏严重,不利于进行病毒与细胞相互作用关系的研究,且作用条件及时间不易掌握。以上缺点可通过使用低温包埋法得到解决。     

肾综合症出血热(HFRS)病毒的形态学研究

应用铁蛋白和辣根过氧化物酶标记抗体间接法染色免疫电镜超薄切片技术对经Vero E—6细胞从HFRS患者血清中直接分离到的二株病毒(H—8205及H—8278株)的形态作了观察。结果在细胞基质内、胞浆空泡内及细胞外查见为免疫复合物和铁蛋白颗粒或酶反应沉淀物包绕的病毒颗粒,园形或卵园形,平均直径108nm,变化范围50—156nm。颗粒有双层膜结构及表面突起,有的囊膜不连续,有小孔通过,颗粒内部为疏松的细颗粒状及微管状结构。两株病毒在形态上无差别。对照组(包括用正常人血清取代恢复期病人血清的对照)未见到类似     

用免疫电镜的方法观察间充质干细胞及再生纤维的超微结构和胶体金标记

本文研究神经再生过程中雪旺氏细胞的功能和作用 ,观察间充质干细胞在体内的存活和功能情况。方法 :以逆转录病毒为载体 ,将EGFP报告基因导入大鼠的骨髓间充质干细胞后 ,注入受损伤的周围神经组织内。三周后取材 ,用FA GA混合固定 ,分为二组 ,A组用K4M低温包埋切片后标记anti EGFP,IgG Au ;B组经冷冻超薄切片后标记anti EGFP ,IgG Au ;观察其超微结构及胶体金标记情况。结果 :电镜下可以观察到A、B二组均呈明显的阳性反应 ,胶体金颗粒均匀地分布在细胞核内及胞浆内。其中K4M低温包埋方法的金颗粒为散在分布 ,超微结构较好 (图 1…     

纤维联接蛋白FN、凝血酶敏感蛋白(TSP)在成纤维细胞及骨髓基质细胞的免疫电镜定位

本文用免疫电镜技术(过氧化酶标记和胶体金标记)在来自兔角膜瘢痕的纤维母细胞和来自小鼠骨髓的长期培养的基质上进行了纤维粘连蛋白(FN),血小板凝血酶敏感蛋白(TSP)定位。结果显示在纤维母细胞和骨髓基质细胞表面以及细胞外细纤维构成的网中。另外,有时在上述二种细胞胞浆中也可以看到FN和TSP的定位。应用免疫电镜技术可以研究各种结缔组织增生性疾病,FN和TSP的分布以及它们和结缔组织增生的关系,为纤维化形成机制以及胶原形成细胞、基质细胞和其它细胞的关系提供了形态学依据。     

精子表面凝集素受体细胞化学检测法研究——Ⅰ.胶体金标记扫描电镜术(G—SEM)

本文建立了精子表面凝集素受体的胶体金标记扫描电镜术(G—SEM)并从方法学上作了探讨。得出结论:1)18nm胶体金用SEM二次电子检测,对于精子这类表面较平滑的游离细胞是可行的;2)对精子而言,G—SEM技术中样品薄层镀金不仅可行而且是必要的;3)G—SEM技术可对精子表面受体、抗原进行定位、定性、定量三结合的研究;4)本文所建立的方法简易可行,可推广应用于对精子表面其它受体、抗原的检测。作者提出了精子G—SEM的二般程序。     

免疫金银扫描电镜法观察血细胞膜的谷胱甘肽过氧化物酶及泛素肽的方法

免疫胶体金标记扫描电镜法是70年代后期发展起来的新技术,对检查细胞膜的抗原分布和变化有特殊的优点,但该法要求较高活性大颗粒(50nm)胶体金和高分辨扫描电镜,目前我们无这种条件,为此,我们将光镜的免疫金银法过渡到扫描电镜。另外,为解决血浆对血细胞的影响,采用了试管内免疫胶体金一次性染色法,用这种方法检查了血细胞膜谷胱甘肽过氧化物酶和泛素肽(Ubiqnitin)效果良好。经各种对照(去抗体;去胶体金;单纯硝酸银;免疫胶金透射电镜检查;)证明扫描电镜下颗粒物是特异性免疫颗粒。说明免疫金银扫描电镜法有应用价值。主要方法步骤是:1.取适量静脉血注入试管,加2％多聚甲醛一戊二醛液与其混匀,在4℃下固定1小时;2.用TBS缓冲液反复冲洗;3.其余程序同免疫金常规     

辛德毕斯病毒（Sindbis Virus）成熟过程的电镜研究

辛德毕斯病毒(Sindbis Virus,以下简称 SbV)属于披盖病毒科,是最小结构最简单的有囊膜的病毒之一,其结构蛋白仅有三种即衣壳蛋白、囊膜蛋白E_1和E_2。病毒的核衣壳在宿主细胞的细胞质中装配,然后转移到细胞质膜下,以出芽的方式披上一层囊膜,发育成为成熟的病毒粒子,出芽成熟过程的动力来自于核衣壳上的衣壳蛋白与细胞质膜上的病毒囊膜蛋白的相互作用。SbV的这种成熟模式十几年前就已提出并得到后来的一些电镜观察结果的支持。近几年来分子生物学的研究结果进一步表明:病毒成熟过程是囊膜蛋白E_2(一种跨膜蛋白)在细胞质中的部分(C末端)与衣壳蛋白相互作用的结果。     

免疫毒素细胞内传递途径的免疫金双标记研究

应用免疫金双标记技术对免疫毒素在细胞内传递途径进行了亚显微形态研究。采用5nm胶体金颗粒标记羊抗鼠、15nm胶体金颗粒标记兔抗蓖麻毒素以及免疫毒素(由抗CD_5、CD_2、CD_8及抗金T细胞的单抗DS27、JN205、P218、P81和蓖麻毒素构成),对免疫毒素与Molt-4细胞(人T淋巴细胞系)的相互作用进行了动态观察及超微结构定位。电镜下,在不同时期的实验动态观察中,两种不同粒径的金颗粒相伴随,共同定位于细胞膜及其突起表面、细胞膜被膜小凹(Coated pit)中,随后进入细胞内,定位于内吞小体(endosome)及其所属小管、小泡、多泡小体及溶酶体,并迅速到达跨高尔基氏复合体网状系统(trans-Golgi network)。实验中还观察到细胞膜表面有分布