EDC法制备黄曲霉毒素B1人工抗原的研究

本研究采用EDC法制备了黄曲霉毒素B1人工抗原，通过TLC与ELISA对制备过程监控，确定了最佳的肟化反应时间与偶联反应时间。同时，就黄曲霉毒B1与牛血清白蛋白的起始摩尔比对偶联产物中这两物质摩尔比的影响进行了研究。结果显示，在25℃肟化反应24h、偶联反应24h，当黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的起始摩尔比为30：1时，得到了黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的摩尔比为5：1的黄曲霉毒素B1人工抗原。     

黄曲霉毒素B1人工抗原的合成及鉴定

采用衍生化在黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1）上引入羧基合成AFB1羧甲基活化物,通过N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimide NHS）法将AFB1O与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA。ECI-MS和紫外光谱法的鉴定结果表明目标半抗原合成成功。结合紫外分光光度法和回归方程,分别测得不同浓度的半抗原和蛋白质线性曲线为：Y=0.1440X+0.0103,R2=0.9986;Y=0.0059X+0.0808,R2=0.9889。偶联物中半抗原和蛋白质的浓度分别为186.32 μg/mL、6127.46 μg/mL,即求得抗原分子结合比为5.13:1,从而为制备抗AFB1抗体奠定基础。     

黄曲霉毒素B1人工抗原及鼠源多克隆抗血清的制备

目的:研究合成并鉴定了黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源AFB1多克隆抗血清。方法:采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimide NHS)法将AFB1分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原AFB1-BSA和包被抗原AFB1-OVA,采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫实验获得鼠源多抗血清,并使用间接ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果:结果表明半抗原AFB1分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;免疫的6只小鼠效价均达1×10-4以上,3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50(50% inhibitive concentration,IC50)为8.199ng/mL。结论:实验成功合成了AFB1人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗体血清,为AFB1单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

盐酸可乐定人工抗原的合成及鼠源多抗血清ELISA鉴定

目的：获得敏感性高,特异性强的新型瘦肉精盐酸可乐定（Clonidine hydrochloride,CLO）鼠源多抗血清。方法：以CLO的衍生物盐酸阿可乐定（Apraclonidine hydrochloride,ACLO）为半抗原,采用戊二醛法将ACLO分别与牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）和鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）偶联,合成免疫抗原CLO-BSA和包被抗原CLO-OVA。采用紫外扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其偶联效果后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清。利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定其免疫学特性。结果：合成的人工抗原免疫效果较好,所获小鼠多抗血清效价均达到1∶12 800以上,其中3号小鼠敏感性最好,半数抑制质量浓度（IC₅₀）为82.75 ng/mL,与其他几种常见的瘦肉精类药物的交叉反应率均小于0.9%,特异性良好。结论：通过戊二醛法成功合成了高免疫原性的CLO人工抗原,并获得敏感性高,特异性强的CLO鼠源多抗血清。     

温度对牛奶中黄曲霉毒素M1检测结果的影响

ELISA（酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒）检测牛乳中的黄曲霉毒素M1方便、快捷,但孵育温度对其检测结果影响很大,实验证明温度过高、过低都会严重影响实验结果。故在ELISA检测的过程中应严格按照ELISA检测说明书上的最佳反应温度孵育,这样才会得到最准确的检测结果。     

胭脂红酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备

为了快速高效检测食品中胭脂红酸含量,本研究通过羟基二咪唑法制备了胭脂红酸人工抗原;通过免疫新西兰大耳白兔获得了胭脂红酸抗血清,经硫酸铵沉淀法分离纯化获得抗胭脂红酸多克隆抗体;利用棋盘滴定法检测了抗体效价,并探究了溶液pH值、离子强度和有机溶剂对ELISA反应的影响,优化出最佳ELISA反应条件;在最佳反应条件下,建立了胭脂红酸的间接竞争ELISA抑制曲线。紫外光谱扫描结果显示,免疫抗原(CA-BSA)和检测抗原(CA-OVA)均与载体蛋白成功偶联;经分离纯化获得的胭脂红酸多克隆抗体效价为1:16000;检测抗原最佳浓度为1μg/m L、ELISA反应最适缓冲液为pH7.4、含50mmol/L Na~+且无甲醇的磷酸盐缓冲液;间接竞争ELISA标准曲线的线性范围为7.8～1150ng/mL,检测限为1ng/mL,灵敏度IC_(50)值为95.2ng/mL。本研究为开发CA快速检测试剂盒对食品中胭脂红酸含量的大量快速测定奠定了基础。     

抗黄曲霉毒素B_1单抗独特型抗体的制备

目的研制黄曲霉毒素B1标准品的替代品并应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)。方法在研制了抗黄曲霉毒素B1单抗的基础上,将抗体用无花果蛋白酶进行酶切,制备出抗黄曲霉毒素B1单抗F(ab’)2片段,并以F(ab’)2片段作为免疫原免疫日本大耳白兔,制备出抗黄曲霉毒素B1单抗独特型抗体,并对该独特型抗体进行鉴定。结果该独特型抗体是Ab2β型,与黄曲霉毒素B1存在内影像关系。结论该抗体可以替代黄曲霉毒素B1标准品应用于ELISA检测。     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

苏丹红Ⅰ结构类似物合成及其人工抗原的制备研究

采用重氮法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物,通过活性酯法将其偶联到载体蛋白上制备人工抗原,竞争ELISA方法测定人工抗原的免疫原性。紫外可见光谱、红外光谱和核磁共振鉴定成苏丹红Ⅰ类似物合成成功并顺利偶联到载体蛋白上,免疫原性鉴定证明该人工抗原可刺激BALB/c小鼠产生苏丹红Ⅰ的抗体,表明苏丹红Ⅰ人工抗原制备成功。     

青霉素G人工抗原的合成及其酶联免疫检测方法研究

在碱性条件下,降解青霉素G并与6-氨基己酸反应,首次成功合成了纯度较高的半抗原.采用活化酯法与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联,成功制备了具有青霉素G结构特征的人工抗原.通过免疫获得了高效价、高特异性的多克隆抗体,抗血清效价达1:240 000.绘制了青霉素G酶联免疫直接竞争法的标准曲线,检测限可达0.04μg/L,灵敏度0.37μg/L.     

DNA吸附消除黄曲霉毒素G1

鉴于黄曲霉毒素G1（AFG1）的毒性强,难降解和有效去除,利用AFG1与DNA的嵌插结合,构建选择性吸附消除AFG1的有效方法。AFG1嵌入DNA的最佳反应条件为pH 7.4及30 ℃,其DNA结合饱和值和去除率为1.66、88.14%。添加NaCl、CaCl2、L-天冬氨酸、葡萄糖、尿素、亮氨酸、赖氨酸、维生素C等后,DNA结合饱和值分别为1.45、1.45、1.29、1.05、1.95、1.95、2.32和2.90。去除率分别为78.08%、76.44%、75.92%、75.16%、88.41%、88.67%、88.87%、90.27%。NaCl、CaCl2、L-天冬氨酸、葡萄糖等负电基团或者离子强度较高不利于AFG1-DNA嵌插结合,而尿素、亮氨酸、赖氨酸、维生素C等带正电基团和相似基团的物质利于AFG1-DNA的嵌插结合。花生油中的AFG1的去除率达到80%以上。动力学相关系数和吸附容量可知,该吸附过程符合准二级动力学模型,表明吸附过程的限速步骤为化学相互作用。吸附过程遵循Freundlich等温吸附模型,该吸附过程为多层吸附。热力学结果显示DNA对AFG1的吸附是自发的放热过程。综上,DNA能选择性吸附AFG1,因此,可进一步开发DNA新型材料,在去除食品中黄曲霉毒素方面有重要意义。     

氨苄青霉素人工抗原的制备及鉴定

本研究采用戊二醛法和物理法制备氨苄青霉素(AMP)人工抗原,以紫外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定偶联成功,采用改良的BCA法测定偶联率分别为8～10和17～21。通过单因素和L9(34)正交试验研究了反应物起始摩尔比、偶联剂的添加量和偶联时间等因素对偶联率的影响,选择最佳的偶联条件。最终确定戊二醛法的最佳反应条件为:反应物起始摩尔比40:1;戊二醛10μl;反应时间4h。物理法的最佳反应物起始摩尔比为20:1,反应时间3h。本研究表明物理法优于戊二醛法,是一种更好的制备氨苄青霉素人工抗原的方法。     

三聚氰胺人工抗原化合物的合成及鉴定

目的：建立三聚氰胺残留的免疫分析方法。方法：以三聚氰胺结构类似物2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪为原料,分别与6-氨基己酸和对氨基苯甲酸,各经两步化学反应合成两种具有不同长度间隔臂的半抗原MEA和MEB,并分别通过碳二亚胺法和混合酸酐法将MEA和MEB与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备三聚氰胺的免疫原(MEA-BSA)和包被原(MEB-OVA)。结果：经质谱和紫外光谱表征,证明所合成的产物为目标半抗原MEA和MEB,并且与载体蛋白偶联比可达到25.28:1(MEA-BSA)和13.11:1(MEA-OVA)。结论：半抗原MEA和MEB及人工抗原合成成功。     

环丙沙星人工抗原的合成及鉴定

通过化学方法制备了环丙沙星的免疫抗原和包被抗原;分别采用碳二亚胺(EDC)法和氯甲酸乙丁酯法把环丙沙星与BSA进行了偶联制备了人工免疫抗原CIP-BSA,EDC法制备了包被抗原CIP-OVA,经PAGE、紫外分光光度法测定了人工合成抗原的偶联比,EDC法和氟甲酸乙丁酯法制得的CIP-BSA两分子结合比率分别为4:1和11:1,CIP-OVA中两分子结合比率为12:1.这为环丙沙星单克隆抗体的制备奠定了基础.     

月饼中黄曲霉毒素B1检测前处理方法的改进

通过对伍仁、蛋黄莲蓉、枣泥、水果、火腿、冰皮和吞拿鱼七种口味,共70批次月饼进行甲醇-水(1∶1,V/V)和三氯甲烷二次抽提两种处理方法对比,结果显示两种方法检测仅伍仁和吞拿鱼月饼差异显著,其余不显著.甲醇水提取方法检测结果重复性良好,加标回收率为84.0％114.7％,提高了月饼黄曲霉毒素B1的检测效率.