静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白的研制

目的研制高效价静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白。方法用甲型H1N1流感疫苗(简称甲流)对固定供血浆者按疫苗说明书免疫后2周开始采集原料血浆,采用血凝抑制法检测原料血浆和制品的甲流抗体效价;采用柱层析法从高效价甲流免疫血浆中提取富含IgM免疫球蛋白的样品,模拟低温乙醇蛋白分离法工艺从小量混合血浆分离IgG样品,测定血浆和提取样品的甲流抗体效价,分析甲流中和抗体效价与IgG、IgM含量的对应关系,判断甲流中和抗体的免疫球蛋白类型;按本公司静脉注射人免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin,IVIG)生产工艺制备静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白,并与普通IVIG及相应合并血浆的甲流抗体效价进行比较。结果筛选到甲流抗体效价≥320 HU/ml的合格血浆9 866袋,合格率达33.5%,其中抗体效价≥640 HU/ml的血浆占合格血浆的49%,血浆质量符合《中国药典》三部(2010版)"血液制品生产用人血浆规程"要求;甲流抗体效价与IgG含量呈相应比例关系,而与IgM含量无关,甲流中和抗体的免疫球蛋白类型以IgG为主;制备的甲流人免疫球蛋白制品的甲流中和抗体效价达2 560 HU/ml,为普通IVIG的197倍,其他质量指标符合《中国药典》三部(2010版)"静注人免疫球蛋白制检规程"要求。结论成功研制了静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白,在甲流疫情得到有效控制的情况下,仍具有战略储备意义。     

高效价巨细胞病毒人免疫球蛋白原料血浆的筛查

目的分析普通健康供浆员中人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)免疫球蛋白(IgG)抗体效价分布情况,筛查富含高效价HCMV IgG抗体的原料血浆。方法采用HCMV IgG定量检测试剂,检测本公司下属广西地区五个单采血浆站采集的血浆样本的HCMV IgG抗体效价,检测抗体效价15 PEI-U/ml的血浆样本混合后的HCMV IgG抗体效价,并对血浆中富含HCMV抗体的供浆员血浆进行采集,分析效价分布变化情况。结果健康供浆员28 607份血浆样本的HCMV IgG抗体阳性率为85.2%,其中效价分布在1~10、10~15、15 PEI-U/ml的各占64.5%、8.7%和11.9%;1 318名血浆中富含HCMV抗体的供浆员8 426份血浆样本HCMV IgG抗体阳性率为98.1%,抗体效价15 PEI-U/ml占43.8%,约为普通健康人血浆样本的3.7倍,3个月内平均抗体效价可维持在15 PEI-U/ml以上的有586人,占44.5%;不同浆站抗体效价15 PEI-U/ml的血浆样本混和后的平均效价为33.72 PEI-U/ml。结论健康供浆员中高效价HCMV IgG抗体的比例较高,部分供浆员HCMV IgG抗体高效价水平可稳定维持3个月,从健康供浆员中采集含高效价HCMV IgG抗体的原料血浆,用于制备巨细胞病毒人免疫球蛋白具有可行性。     

抗乙型脑炎病毒阳性血清抗体效价参考品的制备

目的制备抗乙型脑炎病毒阳性血清抗体效价参考品。方法评估乙脑病毒IgG酶联免疫试剂盒定量检测不同浓度阳性血清抗体的线性范围、准确性、精密性及特异性,并以正常血清及其他免疫球蛋白产品为对照,对该参考品抗体效价定位进行适用性比较。结果不同浓度阳性血清的线性范围为0.625～10IU/ml,抗体效价回收率为91.2%～112.8%,试验内变异系数≤7.8%,正常血清与阳性血清的乙脑抗体效价相差15倍。试验用的阳性血清乙脑病毒抗体效价设为10U/ml时,在特定的疫苗免疫程序下,效价峰值期能够实现合格血浆≥50%的收获率。结论兼顾原料血浆的可获取性与产品临床效果的难以替代性,特定阳性血清定位为10U/ml。     

人血狂犬病免疫球蛋白的研制

采用人用狂犬病疫苗，对健康献血员进行7外基础免疫和3针加强免疫，采集高效价的狂犬病免疫血浆，按常规方法分离提制狂犬病免疫球蛋白（HRIO）。该制剂的蛋白质浓度为10％，γ-球蛋白纯度＞98％，lgG单体及二聚体含量＞90％，狂犬病抗体含量＞100lU／ml。该制剂为冻干剂型，效价稳定，安全性好，便于运输和保存．     

静注巨细胞病毒人免疫球蛋白原料血浆的筛选及制备

目的筛选获得高效价血浆并制备静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(intravenous immunogloblin against cytomegalovirus,CMV-IVIG)。方法分别使用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法及微量细胞中和法对113份人血浆巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)IgG抗体进行结合效价及中和效价的检测,将两种方法获得的高效价血浆分别制备CMV-IVIG,采用常规微量细胞中和法检测抗CMV中和效价,并与IVIG中和效价进行比较,确定符合要求的免疫球蛋白成品,确立血浆筛选方法。结果对113份血浆进行效价检测,将结合效价≥20 IU/mL以及中和效价≥1∶32的血浆分别收集并制备5%CMV-IVIG,成品批号分别20190401和20190402;20190401批CMV-IVIG成品中和效价为498.28 IU/mL,20190402批CMV-IVIG成品中和效价为2 357.56 IU/mL,而5%IVIG中和效价为259.53 IU/mL。结论 ELISA法筛选获得的血浆制备的CMV-IVIG中和效价为普通IVIG的1.92倍,不符合特异性免疫球蛋白不低于普通免疫球蛋白4倍的效价判定标准,微量细胞中和法筛选获得的血浆制备CMVIVIG中和效价为普通IVIG的9.08倍,符合效价判定标准,表明微量细胞中和法可用于CMV高中和效价血浆的筛选,为CMV-IVIG的制备提供合格的血浆原料。     

献浆员中呼吸道合胞病毒中和抗体效价分布及高效价血浆筛选

目的分析献浆员中呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)中和抗体效价分布情况,筛选高效价RSV中和抗体血浆,用于制备特异性RSV免疫球蛋白。方法对600份血浆进行倍比稀释,采用微量中和试验法对血浆中的RSV中和抗体效价进行检测,选择合适稀释度作为大规模血浆检测稀释点。以单一稀释度对2 976份血浆的RSV中和抗体进行检测,并对高效价混合血浆进行检测和评价。结果 600份血浆中,血浆RSV抗体效价≥1∶64占65.5%,≥1∶180占18.3%,≥1∶256占11.2%。以1∶200稀释度对2 976份血浆进行筛选,共筛选出463份血浆,占15.5%。463份混合血浆的RSV中和抗体效价达到普通混合血浆的4倍。结论经本方法筛选出高效价的血浆,用于制备特异性RSV免疫球蛋白是可行的。     

高效价抗肠道病毒71型兔血清的制备及鉴定

目的制备高效价的抗肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)兔血清。方法分别用RD细胞和Vero细胞培养EV71,纯化后,将经甲醛灭活和未灭活的EV71抗原分别加入佐剂或不加佐剂,经不同途径(肌肉、皮下、腹腔)免疫家兔,每周采血,分离血清,分别采用ELISA、免疫双扩散、免疫荧光和中和抗体试验检测兔血清抗体效价,并分析不同方法检测兔血清抗体结果的相关性。结果未灭活和灭活的纯化EV71抗原加弗氏佐剂后,经皮下或肌肉途径免疫家兔均可获得高效价的抗EV71兔血清,其中加弗氏佐剂的灭活疫苗经皮下途径免疫获得了最高滴度的中和抗体;当抗血清ELISA效价达到或接近1∶108,免疫双扩散效价达到或接近1∶512,抗血清1∶2 000稀释后荧光强度荻时,可进行免疫家兔的全血采集;不同方法免疫家兔全血采集的血清中和抗体效价为29 406~1 280 652 U/0.2 ml;免疫双扩散检测与中和抗体和免疫荧光检测结果的相关性较高。结论获得了高效价的抗EV71兔血清,为EV71疫苗抗原的相关检定创造了条件。     

金黄地鼠作为狂犬病暴露后疫苗免疫动物模型的应用

目的以金黄地鼠作为动物模型,评价不同种类狂犬病疫苗在暴露后免疫中的保护效果。方法将不同类型狂犬病疫苗分别免疫两组金黄地鼠,一组为未感染过病毒的健康动物(Pr EP),另一组为感染过CVS株的动物(PEP),免疫后不同时间点通过心脏穿刺采血,RFFIT法测定血清抗体效价。对PEP组动物同时观察其死亡情况,分析各动物抗体水平与保护效果的相关性。另以4.0 lg MICLD_(50)/ml的CVS狂犬病固定毒株感染金黄地鼠左腿腓肠肌,每只0.2 ml,6 h后开始以不同类型狂犬病疫苗按0、3、7、14 d程序免疫,观察疫苗对动物的保护效果。结果暴露后免疫组(PEP)的血清抗体可在第4天出现阳性,第5天达100%,以后持续维持较高水平。未感染的暴露前免疫(Pr EP)动物的抗体水平从第4天开始一直较PEP组低。但PEP组中不同疫苗免疫的各动物中均观察到免疫后第4天及以后的抗体水平与最终该动物的发病死亡无相关性。高效价人用狂犬病疫苗的免疫保护率为80%,但疫苗原液分别稀释2倍和5倍后,保护率分别降至30%和20%。疫苗加PIKA佐剂作相同倍数稀释后,保护率可达80%,疫苗联合使用免疫球蛋白,暴露后保护率可达100%,未免疫的感染对照组动物的死亡率在90%左右。结论以金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫的动物模型可对不同质量疫苗作出有效评价。疫苗的效价与暴露后免疫中的保护作用有相关性,疫苗联合使用免疫球蛋白注射是最佳的暴露后免疫方案;PIKA佐剂在降低疫苗抗原量的同时提高了疫苗的保护作用;暴露后抗体水平未显示与保护效果具有相关性。     

两种免疫途径制备的肠道病毒71型兔血清抗体效价比较

目的比较两种免疫途径制备的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)兔血清抗体效价。方法将EV71灭活疫苗原液分别经皮下及肌内注射途径免疫两组家兔,每组5只,剂量均为5μg/只,两组均分别于0、7、14及28 d各免疫1次,初次免疫抗原与等量弗氏完全佐剂充分混合,后续免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂充分混合。两组均于初次免疫前及每次免疫后7 d经家兔耳缘动脉采血,分离血清,检测血清中和抗体效价。结果两种免疫注射途径均可诱导家兔产生较高的抗体效价,7只家兔血清抗体效价均 1∶10 000,皮下注射组有3只,肌内注射组有4只;肌内注射组血清抗体效价整体优于皮下注射组,在初次免疫后第21天时尤其明显(P 0. 05)。结论肌内注射途径制备的兔血清抗体效价高于皮下注射,本实验为今后制备高效价血清抗体提供了参考。     

鼻腔喷雾重组乙型肝炎疫苗在小鼠体内免疫原性的评价

目的评价鼻腔喷雾重组乙型肝炎疫苗(简称鼻喷乙肝苗)在小鼠体内的免疫原性。方法分别采用含铝剂的乙肝苗(肌注)及不同剂量鼻喷乙肝苗免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清中anti-HBs水平,ELISPOT法检测小鼠脾细胞中IFNγ及IL-2水平;采用不同剂量鼻喷乙肝苗免疫小鼠,间接ELISA法检测小鼠肺及生殖道灌洗液中sIgA效价。联合使用含铝剂的乙肝苗(肌注)及鼻喷乙肝苗或单独使用含铝剂的乙肝苗(肌注)免疫小鼠,比较不同免疫程序(先肌注后鼻喷乙肝苗或相反)对小鼠血清中anti-HBs及脾细胞中IFNγ、IL-2水平的影响,同时考察先肌注后滴鼻免疫程序诱导anti-HBs抗体水平的持久性。结果相同剂量鼻喷乙肝苗诱导产生的anti-HBs抗体水平明显低于肌注乙肝苗(P 0.001),将鼻喷乙肝苗的免疫剂量提高4倍可诱导出与肌注乙肝苗相当的HBsAb抗体水平;鼻喷乙肝苗还可诱导远端局部生殖道黏膜产生一定水平的sIgA抗体。与单独使用肌注乙肝苗比较,先肌注后滴鼻乙肝苗的小鼠产生anti-HBs抗体水平差异无统计学意义(P 0.05),脾淋巴细胞中IL-2及IFNγ水平明显升高(P 0.001);且该免疫程序诱导的较高anti-HBs水平至少可维持12周。结论鼻喷乙肝苗具有较好的免疫原性,与含铝佐剂乙肝苗联合使用可诱导较高水平的anti-HBs抗体,还可提高细胞免疫水平,且具有良好的持久性。     

SARS特异性免疫球蛋白的制备及相关指标的检定

目的　分析人SARS特异性免疫球蛋白的抗体效价和S D病毒灭活残留物含量。方法　采用ELISA和蚀斑实验 ,检测SARS康复患者血浆及免疫球蛋白制品的SARS病毒IgG抗体和中和抗体效价 ;以HPLC和气相色谱检测制品中TritonX 10 0和TNBP残留量。结果　由多人份SARS康复患者混合血浆制备的静脉注射用人SARS特异性免疫球蛋白样品IgG抗体和中和抗体效价提高 5倍以上 ;TritonX 10 0和TNBP残留量均低于规定值。结论　经S D病毒灭活的静脉注射用人SARS特异性免疫球蛋白符合现行规程要求。     

成人乙型肝炎疫苗多次免疫无应答者再接种甲乙型肝炎联合疫苗的免疫效果

目的探讨成人乙型肝炎疫苗免疫对策。方法对多次免疫后抗-HBs仍为阴性的228名研究对象接种甲乙型肝炎联合疫苗,按0、1、6个月20μg×3免疫程序进行免疫,于210d抽血,采用放射免疫法进行抗-HBs检测。结果228名乙型肝炎疫苗多次免疫无应答者,接种甲乙型肝炎联合疫苗后,抗-HBs阳性172名,阳转率75.44%,抗体几何平均滴度(GMT)为197.20m IU/ml。结论对成人乙型肝炎疫苗多次免疫无应答者,增加接种剂量或接种甲乙型肝炎联合疫苗,可提高抗-HBs阳转率。     

应用脾直接免疫法制备HCG单克隆抗体

应用脾直接免疫方法制备HCC单克隆抗体,获得了高效价BALB/c小鼠抗血清。稀释到1:150倍仍为强阳性(ELISA法)。采用上述方法用HCG免疫小鼠的脾细胞与NS-1细胞融合生成的杂交瘤细胞所分泌的抗体效价为1:6000以上(ELISA法)。脾直接免疫方法与传统免疫方法相比较,操作简便,免疫时间短,节省抗原。利用此方法获得分泌特异性抗体的杂交瘤与同一抗原,按传统方法免疫动物获得的杂交瘤所分泌的抗体,在效价上和抗体特异性上没有差别。是一种很实用的免疫方法。     

生产场地变更后甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)的抗原特性

目的研究生产场地变更后,原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)的抗原特性。方法采用双抗体夹心ELISA法检测在新场地制备的甲肝灭活疫苗病毒浓缩液和疫苗原液的甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原含量。SDS-PAGE和Western blot分析二者的蛋白组分和特异性;疫苗成品(成人剂量)稀释为不同剂量(640、320、160、80和40 EU),免疫ICR小鼠(并设铝佐剂对照组),采用竞争ELISA法检测小鼠血清中HAV抗体效价;同时称量免疫后不同时间小鼠体重。结果病毒浓缩液和疫苗原液的HAV抗原含量分别为12 800和3 200 EU/ml。疫苗原液中仅含HAV结构蛋白组分,且可与HAV抗体特异性结合。初免后28 d,640、320和160 EU剂量疫苗组小鼠血清抗体阳转率为100%,80和40 EU剂量疫苗组二免后血清抗体阳转率达100%和90%,所有免疫组小鼠血清抗体效价二免后14 d较初免28 d上升约2倍;疫苗免疫组小鼠体重及体重增幅与佐剂对照组相比,均无药物作用引起的异常变化(P0.05)。结论在新场地采用原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗原液有单纯的抗原蛋白组分和免疫学特异性,且与前期研究结果相比,其免疫原性及安全性具有一致性。     

高效价麻疹抗血清的制备及检定

目的制备高效价麻疹抗血清,用于疫苗检定中病毒鉴别、支原体检测、麻腮二联和麻腮风三联疫苗的联合滴定试验。方法将麻疹病毒L4株于Vero细胞中传代培养,获得高滴度病毒原液,制备免疫抗原,分别经腹腔注射法、耳静脉注射法和背部皮下多点注射法免疫家兔,制备抗血清,并按规程要求对抗血清进行检定。结果采用腹腔注射法、耳静脉注射法和背部皮下多点注射法免疫家兔所制备的抗血清的中和效价分别为1∶960、1∶2 560和1∶3 840,经检定,3种方法制备的抗血清均达到疫苗检定的使用要求。结论背部皮下多点注射法制备的麻疹抗血清效价最高,且操作简单,可作为制备高效价麻疹抗血清的最佳方案。     

CA16疫苗候选株特异性免疫血清保护性的初步评价

目的评价CA16 K168/8疫苗候选株免疫血清对不同CA16毒株的交叉中和能力及对致乳鼠麻痹CA16临床分离株的体内中和保护能力。方法将CA16 K168/8疫苗候选株病毒纯化液辅以弗氏佐剂经背部及侧腹部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,制备高效价免疫血清。采用微量细胞病变法检测中和抗体效价;用中和抗体效价终浓度为32 U的特异性免疫血清对18株不同CA16临床分离毒株及15株EV71毒株进行交叉中和指数检测;选取中和抗体效价为16、32、64、128、256 U的特异性免疫血清对可致乳鼠产生明显麻痹作用的CA16 FY-18株进行体内中和保护水平检测。结果获得的兔抗CA16 K168/8血清对14株CA16毒株的中和效价为1∶1 024~1∶6 144,GMT值为1∶3 153;可于体外完全中和18株不同CA16毒株,中和指数为100~5 623.4,平均值为794.1,而对15株EV71临床分离株中和指数仅为0.32~5.62,平均值为2.2;体内中和保护水平随抗体效价升高而增加,呈量-效关系,当中和抗体效价达128 U时,可完全保护乳鼠不发生临床麻痹反应。结论 CA16 K168/8疫苗候选株特异性免疫血清体内、外试验结果表明其具有良好的免疫保护性。     

细胞核染色法检测人免疫球蛋白类制品巨细胞病毒中和抗体效价

目的检测静注免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)(p H 4)及巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)免疫球蛋白(IG)中的CMV中和抗体效价。方法采用基于微量细胞病变的细胞核染色法检测39批国产IVIG、8批注册检验巨细胞病毒免疫球蛋白(CMV-IG)以及2批国外CMV-IG制品的CMV中和抗体效价。结果 39批IVIG的CMV中和抗体效价几何平均值为361 U/ml,最低效价为234 U/ml,最高效价为502 U/ml;8批注册检验CMV-IG的CMV中和抗体效价几何平均值为1 113 U/ml,最低效价为923 U/ml,最高效价为1 553 U/ml;2批国外CMVIG的CMV抗体效价分别为579 U/ml和163 U/m。8批注册检验CMV-IG的CMV中和抗体效价显著高于39批IVIG的CMV中和抗体效价(P0.001)。结论国产39批IVIG的CMV中和抗体效价在234~502 U/ml之间,经血浆筛查后投浆制备的CMV-IG显著高于普通IVIG的CMV中和抗体效价。     

四川地区供浆员中肠道病毒71型中和抗体效价的分布

目的通过检测EV71中和抗体效价(EV71-NT),对四川地区供浆员中EV71-NT的分布进行分析。方法应用基于细胞病变抑制的EV71-NT检测方法,检测四川地区349份健康人血浆的EV71-NT,同时用肠道病毒(EV)71型抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)检测其EV71抗体,并分析二者的相关性;检测四川地区21 817份健康人血浆中EV71-NT的分布。结果该EV71-NT检测方法具有较好的重复性,测定高效价和低效价EV71中和抗体标准品的变异系数分别为30.9%和33.6%;该方法与ELISA法的相关性较差(r=0.024);四川地区21 817份健康人血浆中含高效价EV71中和抗体的比例在7.1%～18.4%之间,EV71高效价血浆占10.3%。结论在四川地区供浆员血浆中含有一定比例的高效价EV71中和抗体,可以直接从自然感染人群中筛选EV71抗体血浆进行EV71特异性免疫球蛋白的研制。     

抗轮状病毒IgY的研制

目的用鸡卵黄制备抗轮状病毒（ＲＶ）免疫球蛋白,预防和治疗婴幼儿ＲＶ感染。方法制备ＲＶ 抗原,通过不同途径免疫母鸡,几种纯化方法联合应用从鸡卵中提取特异性鸡卵黄抗体（ＩｇＹ）,进行理化学检定及动 物效力实验。结果免疫母鸡均可产生特异性ＩｇＹ,纯度可达９１％以上,产量为４４ｍｇ／蛋;可保护乳鼠兔受ＲＶ攻击; ＩｇＹ耐热、耐酸,室温保存半年、４℃两年效价不变。结论已成功地应用ＲＶ免疫母鸡制备出高效价特异性抗ＲＶ－ＩｇＹ。     

低pH病毒灭活工艺对抗人淋巴细胞免疫球蛋白质量的影响

抗人淋巴细胞免疫球蛋白（ＡＬＧ）是由多份猪免疫血浆为原料制备的产品，免疫所用的抗原来源于人的淋巴细胞，同时在ＡＬＧ生产过程中，使用了人血浆、人红细胞以及人胎盘组织吸收杂抗体。尽管对所用的人源性原料中血源性病毒实行了越来越严格的筛选，但由于筛选方法本身的限制和感染窗口期的存在，人源性原料的污染很难避免。因此有必要对ＡＬＧ中人源性病毒进行灭活。本文对抗人淋巴细免疫球蛋白进行病毒灭活后的质量进行了分析。结果抗人淋巴细胞免疫球蛋白通过低ｐＨ孵化２４天后（ｐＨ４．１±０．３），其免疫效价仍不低于１：４００…