烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

烟草NtGGPPS4基因的克隆和功能初步分析

为明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Nt GGPPS4的功能,从普通烟草中克隆到该基因,构建了超量表达载体p CAMBIA1300-Nt GGPPS4,并通过农杆菌介导法转化烟草。进一步测定了转基因烟株中西柏烷二萜醇和质体色素的含量。结果表明:共鉴定出4株Nt GGPPS4表达量明显升高的转基因植株,且转基因植株中α-西柏三烯二醇(α-cembrenediol,α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-cembrenediol,β-CBD),以及新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素等6种质体色素含量都有显著提高。表明Nt GGPPS4参与了烟草西柏烷二萜醇和类胡萝卜素的生物合成。     

过表达Lcy-b基因对烟草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响

为揭示类胡萝卜素代谢关键基因番茄红素β-环化酶基因(Lycopene beta-cyclase,Lcy-b)对类胡萝卜素及香气物质代谢的影响,通过同源克隆法获得烟草品种K326 Lcy-b基因c DNA全长序列。采用农杆菌介导法导入烟草,测定Lcy-b过表达对类胡萝卜素各组分及烤后样香气物质含量的影响。序列分析表明:K326 Lcy-b基因包含一个1503bp的开放读码框(ORF),编码500个氨基酸。预测蛋白二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,蛋白质分子量为56.06KDa,理论等电点(p I)为6.98。部分过表达阳性植株Lcy-b基因的表达量显著高于对照,类胡萝卜素组分中的β-胡萝卜素、新黄质、紫黄质比例增加,叶黄素所占比例降低。过表达植株烤后样β-胡萝卜素降解产物显著高于对照,而叶黄素降解产物则低于K326对照或与对照相当。研究结果说明Lcy-b过表达可以改变烟草类胡萝卜素组分比例,影响烤后烟叶香气物质含量。     

NtGGPPS4基因RNAi载体构建与功能分析

为研究NtGGPPS4在合成烟草萜类化合物中的功能,构建了该基因的RNAi表达载体pHellsgate2-NtGGPPS4,通过农杆菌介导法进行遗传转化。使用荧光定量PCR技术检测转基因烟株中NtGGPPS4的表达量,采用溶剂萃取法从转基因烟株中提取西柏三烯醇和质体色素,并分别使用GC-MS、LC-MS测定其含量。结果表明,在NtGGPPS4表达量明显下降的转基因烟株中,α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、新黄质、紫黄质、β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b和叶黄素的含量明显下降。表明NtGGPPS4参与调控了烟叶中西柏三烯醇和质体色素的生物合成。     

类受体蛋白激酶NtFERL对烟草质体色素含量的影响

为明确烟草NtFERL(FER-like gene)的生物学功能,同源克隆NtFERL基因并进行序列分析,同时采用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silence, VIGS)方法在本氏烟草中对该基因进行功能分析。结果表明:NtFERL基因位于烟草第7号染色体上,无内含子,编码序列长2 670 bp,编码889个氨基酸。NtFERL与拟南芥FERONIA基因同源性较高,在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别为68.8%和71.1%。沉默NtFERL后,烟草叶色泛黄。质体色素含量分析显示,除新黄质外,叶绿素a、叶绿素b、β-胡萝卜素、叶黄素均显著降低,表明NtFERL可能对烟草色素含量起着正调控的作用。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

RP-HPLC法测定烟草中的质体色素

为了快速测定烟草及其制品中的质体色素,考察了萃取溶剂、萃取方式、萃取时间、流动相、柱温和柱流速对测定结果的影响,建立了同时测定烟草样品中6种质体色素的方法,并采用该法测定了10种烟草样品中的质体色素.结果表明:①烟草样品中的色素用90%丙酮溶液超声提取20 min效果较好;②用Waters Nova-Pak-C18作色谱柱,异丙醇和乙腈-水(体积比80:20)为流动相,梯度洗脱,流速0.5mL/min,6种色素均能完全分离;③该法的回收率为96.7%-110.7%,RSD均小于5%;④2种新鲜的冻干烟叶样品中均检测出了新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素b、叶绿素a、B-胡萝卜素等色素,且其含量较高,而原烟及卷烟烟丝中仅检测出了叶黄素和β-胡萝卜素,且其含量也较新鲜烟叶低得多.该方法适合批量烟草样品中这6种质体色素的快速分析.     

烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

成熟叶片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况,本研究以普通烟草红花大金元为材料,采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示,烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和LYCE呈现下调表达,类胡萝卜素降解基因LOX、POD和CCD1呈现上调表达,PAL和PPO呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因ZEP、NXS、NCED呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因ORANGE、HY5、COP1、DET1呈现下调表达,而MYB5b、Cry-2呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老,类胡萝卜素合成减弱,而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。     

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

  目的  为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。  方法  从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。  结果  NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和NtMYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸（ABA）合成基因NtNCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。  结论  NtMYB68转录因子能抑制NtZEP和NtNCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。      

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析

为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因的表达模式和功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T_0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。     

宽皮柑橘浮皮时脱落酸积累变化及其代谢基因表达特征

采后柑橘果皮大量积累脱落酸（abscisic acid,ABA）,且ABA生物合成主要通过类胡萝卜素合成途径。为探究宽皮柑橘浮皮发生过程中ABA含量变化及其代谢基因表达特征,本研究以‘克里曼丁’和‘椪柑’为试材,利用高效液相色谱-串联质谱和实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析18～20 ℃贮藏30 d后浮皮果实果皮和正常果皮中ABA含量、类胡萝卜素组分及ABA代谢基因表达水平。结果表明,‘克里曼丁’和‘椪柑’贮藏期间果实浮皮指数分别增加了177%和186%,果皮水分质量分数分别提高了5.9%和14.4%。与正常果皮相比,‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮果实果皮ABA含量显著降低（P＜0.05）,分别从1 659.2、464.6 ng/g降低至795.1、230.5 ng/g。经Pearson相关性分析发现,‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮时果皮ABA含量与β-胡萝卜素含量及LCYB1、LCYE、AB1相对表达量呈显著相关（P＜0.05）。浮皮时,ABA合成基因LCYB1相对表达量显著降低、LCYE相对表达量显著增加（P＜0.05）,致使β-胡萝卜素含量显著降低（P＜0.05）,而β-胡萝卜素合成量的减少抑制了ABA合成。浮皮时,ABA分解基因AB1相对表达量显著增加（P＜0.05）,从而抑制了ABA积累。综合分析认为,浮皮时ABA含量降低与β-胡萝卜素合成量下调及ABA分解加快有关,主要由LCYB1、LCYE、AB1共同调节。此外,本研究认为柑橘果实浮皮的发生可能是由果皮衰老相对延迟所致。     

硅和苯并噻二唑诱导烟草抗青枯病的机理分析

为了揭示叶面喷施矿质元素硅(Silicon,Si)和植物诱抗剂苯并噻二唑(Benzothiadiazole,BTH)对烟草抗青枯病的影响机制,分析测定了Si和BTH处理后烟株根系青枯病菌及根茎叶的硅含量(质量分数)、叶片防御酶系活性、叶片抗性相关基因的表达量,以及室内、田间烟草青枯病发病情况。结果表明,Si和BTH处理后的烟草根系青枯病菌含量[log(CFU)/g]均显著降低,且Si处理能够显著增加烟草根系的硅含量;Si和BTH处理后烟株叶片中的防御酶系活性均增强,其中Si处理可显著提高过氧化物酶(POD)与β-1,3-葡聚糖酶(GLU)的活性,BTH处理能显著增强β-1,3-葡聚糖酶(GLU)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性;Si和BTH处理对烟草抗性基因的表达量也有显著影响,EFE26、ACC Oxidase、HIN1和PR2的表达量均显著提高,其中BTH处理后PR1、PR1a/c、EFE26、ACC Oxidase和HIN1的表达量显著高于Si处理,而Si可显著提高PR2的表达量,且显著高于BTH处理。Si是通过烟草根系硅含量的积累来抵抗青枯病菌的侵染,BTH则是以抗性相关基因表达量的显著提高来诱导烟草对青枯病的抗性。由此可见,叶面施用Si和BTH是以不同的途径诱导烟草抵抗青枯病。     

β-胡萝卜素对H2O2诱导的斑马鱼肝损伤的保护作用

研究β-胡萝卜素对H2O2诱导的斑马鱼肝损伤的保护作用。选择适宜浓度的H2O2诱导斑马鱼肝脏氧化应激损伤,分别以5、10、20 μg/mL的β-胡萝卜素对其进行保护。给药48 h后检测组织匀浆中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活力和丙二醛（malondialdelyde,MDA）含量;苏木精-伊红染色观察斑马鱼肝组织病理变化情况;实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测SOD、CAT和GSTP2以及核转录因子Nrf2 mRNA的相对表达量。结果表明：H2O2处理斑马鱼仔鱼48 h后,组织匀浆液中ALT和AST活力升高,SOD活力降低,MDA含量升高;与模型组比较,β-胡萝卜素能够抑制ALT和AST的升高,提高SOD活力,降低MDA含量;病理切片结果显示β-胡萝卜素组能显著改善斑马鱼肝脏组织病理形态;提高Nrf2 mRNA的相对表达量,上调抗氧化酶基因的相对表达量。β-胡萝卜素对H2O2诱导的斑马鱼肝损伤具有保护作用。     

纸葡萄穗霉降解β-胡萝卜素的产香研究

从采自云南昆明的22份不同陈化时间的烟草样品中筛选到6株可降解β-胡萝卜素的真菌。菌株YNCA9037可降解β-胡萝卜素,获得具甜木香味的发酵产物,经菌落形态、显微形态及转录间隔区(ITS)序列分析进行菌株分类鉴定,菌株YNCA9037初步鉴定为纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)。对菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素的产香条件进行初步研究,其较佳产香的条件为:pH 6.5,发酵温度28℃,发酵时间72 h,β-胡萝卜素添加量0.2%。菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素的发酵产物经气质联用(GC-MS)法分析,检测到致香物质β-环柠檬醛和β-紫罗兰酮。     

β-氨基丁酸对铜胁迫下烟草生长的影响

为了有效缓解铜胁迫对烟草的危害,设置了不同浓度β-氨基丁酸(BABA)处理对铜胁迫下烟草幼苗生长、活性氧代谢的影响以及相关铜离子运输基因的表达试验。结果表明:在100μmol/L Cu SO4胁迫下,烟草生长受到抑制,与未经BABA处理的烟草幼苗相比,经过BABA处理的烟草幼苗根长和鲜质量呈上升趋势。0.5 mmol/L Cu SO4胁迫下,0.2和0.5 mmol/L BABA处理降低了铜胁迫下烟草幼苗体内丙二醛含量(MDA,μmol/g)和过氧化氢含量(H2O2,mol/g),并且提高了抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD,过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶APX)活性。同时调节烟草体内二价金属离子运输的Nt NRAMP,Nt YSL以及Nt PDR基因的表达量显著提高。因此,BABA通过调节烟草体内抗氧化系统和相关金属离子运输基因的表达来缓解铜胁迫对烟草生长的影响。     

烤烟碳氮代谢关键酶活性动态及其与类胡萝卜素关系研究

以红花大金元、K326为试验材料,采用大田种植方式,研究了不同基因型烤烟叶片碳氮代谢关键酶的活性动态及其与类胡萝卜素的相关性。结果表明,在烟草生长发育过程中,硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖转化酶和淀粉酶活性均呈现先上升后降低的变化规律,硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和淀粉酶在移栽后60 d达到最大值,而蔗糖转化酶活性最大值出现在移栽后75 d。类胡萝卜素各组分（β-类胡萝卜素、叶黄素、新黄质和紫黄质）含量随着生育进程的推移,呈下降趋势。在整个生育期内,红花大金元叶片硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖转化酶和淀粉酶活性以及类胡萝卜素各组分含量均高于K326。相关分析结果表明,蔗糖转化酶活性与类胡萝卜素各组分含量呈显著负相关。     

利用VIGS技术研究NtbHLH93基因在烟草甾醇代谢中的功能

为进一步研究烟草NtbHLH93基因的功能,利用病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silence,VIGS)技术降低烟草中NtbHLH93基因的表达。通过测定pTRV2-NtbHLH93烟株中的甾醇含量,发现NtbHLH93基因表达下调后,总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇的含量显著降低。转录组测序发现NtbHLH93基因下调后,共有259个基因差异表达。对这些差异表达基因进行KEGG表达通路分析,发现质体萜类代谢2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate, MEP)途径中有两个基因(Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1)上调表达,这两个基因与MEP途径中的牻牛儿基牻牛儿基还原酶(Geranylgeranyl diphosphate synthases, GGPPS)基因序列高度相似,推测当甾醇合成代谢通路受阻后导致Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1基因上调表达。     

烟叶落黄过程中烟碱代谢规律及相关基因表达分析

为探究烟草叶片落黄衰老过程中生物碱组分变化及代谢相关基因表达情况,以红花大金元为材料,气相色谱-质谱联用法测定中部烟叶生物碱含量,利用已有的烟草叶片衰老转录组数据(RNA-seq),分析叶片衰老成熟期烟碱代谢相关基因的表达水平,同时实时荧光定量PCR验证基因表达。结果显示,烟草进入成熟衰老期,叶片中烟碱、去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明等生物碱含量逐渐升高,烟碱转运蛋白基因JAT1、NUP1,烟碱转化基因CYP82E2、CYP82E4,烟碱合成基因ADC1、ODC2、BBL2以及烟碱代谢调控基因COI1、JAZ1、MYC2、MYC3呈现上调表达,而调控基因MTHFR1下调表达。差异表达基因协同调控烟碱代谢过程,影响衰老叶片中的烟碱合成与积累。