烟草NCED3 基因的克隆及其干旱胁迫表达分析

为揭示9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED) 在烟草生长发育过程中的功能,通过同源克隆方法获得烟草品种K326 类胡萝卜素降解关键基因NCED3 两个cDNA 全长序列。序列分析表明:K326 NCED3-1 和NCED3-2 基因分别包含一个1842bp 和1830bp 的开放读码框(ORF), 各编码613 个和609 个氨基酸。预测蛋白质分子量分别为68177.8 Da 和67754.2Da,理论等电点(pI) 各为7.66 和7.28。跨膜区预测、亲水性和信号肽分析表明很可能是定位于线粒体膜上的亲水性跨膜蛋白。二级结构预测模型显示此蛋白结构以β 折叠和无规则卷曲为主。蛋白三级结构预测分析表明NCED3-1 与NCED3-2 空间结构极为相似。PEG6000 胁迫分析表明,干旱胁迫可以诱导NCED3 基因表达以及内源ABA 的积累。且在处理12h 之前,NCED3 表达与ABA 累积速度均呈现升高趋势,之后逐渐降低。研究结果为解析NCED3 在烟草抗旱方面的功能提供一定的研究基础。      

烟草绿原酸合成关键基因NtHQT1的克隆及表达分析

绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)是烟叶中含量最高的多酚类物质,羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶(Hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是植物绿原酸合成代谢途径中的关键酶。为研究HQT基因在烟草绿原酸合成中的作用机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个新的HQT基因,命名为Nt HQT1。生物信息学和激素处理后基因表达模式分析结果表明:Nt HQT1 c DNA全长1 305 bp,编码435个氨基酸,Nt HQT1定位在细胞质中,属于疏水性蛋白,其二级结构主要是螺旋和无规则卷曲;茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、生长素(3-Indoleacetic acid,IAA)、独角金内酯类似物(GR24)、细胞分裂素(6-Benzylaminopurin,6-BA)和赤霉素(Gibberellic acid,GA)能明显上调Nt HQT1基因的表达,脱落酸(Abscisic acid,ABA)对基因表达没有明显作用,预示Nt HQT1基因在烟草生长发育和抗病等生物学过程中发挥重要作用。      

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）是植物海藻糖代谢过程的关键酶,在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员,本研究通过生物信息学的方法,在普通烟草基因组中共鉴定出了15个TPP基因,其中7个TPP基因定位在染色体上。系统进化分析发现,新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族,分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ。共线性分析表明,有5个烟草Nt TPP基因分别与7个拟南芥AtTPP基因形成同源基因对。启动子分析发现,NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现,NtTPP基因表达具有一定的组织特异性,大部分NtTPP基因在根中的表达量最高,有12个NtTPP基因在干旱胁迫下表达量上调,13个NtTPP基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。     

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱     

烟草NtbZIP038的克隆、鉴定及表达模式分析

碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子是植物中数量最多、最具有多样性的基因家族之一,对植物生长发育及胁迫响应具有重要作用。为探究烟草中bZIP转录因子的生物学功能,本研究在烟草K326中克隆得到一个bZIP转录因子基因NtbZIP038,并对其保守结构域进行分析,利用qRT-PCR技术检测了该基因的表达模式,进一步结合亚细胞定位及转录激活试验对其功能进行了初步鉴定。结果表明,NtbZIP038含有典型的bZIP结构域,亚细胞定位于细胞核中并具有转录激活活性。表达模式分析表明,NtbZIP038在根中表达量最高（p<0.001）,并在盐、干旱、冷、热、脱落酸（ABA）等非生物胁迫下都有明显的表达量变化,在ABA处理下尤其明显（p<0.001）。因此,作为bZIP家族中的一员,NtbZIP038转录因子可能在烟草根系发育、ABA响应与非生物胁迫中扮演着重要的角色。     

烟草SOC1基因的克隆和表达分析

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANTS 1（SOC1）基因属MADS-box转录因子家族,在植物成花诱导过程中起关键作用,但在营养生长过程中的调控功能还未获得充分研究。为明确SOC1基因在叶片中的生理作用,克隆到烟草中SOC1基因的完整开放阅读框,全长806bp。农杆菌介导转化烟草后,获得26棵转基因植株,其中23棵鉴定为阳性植株,转化率为88.46%。与野生型烟草K326相比,获得的SOC1过表达烟株开花提前,株高增加,叶片宽大。半定量RT-PCR结果显示,SOC1过表达不影响叶片中Rubisco大亚基、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶基因的表达水平,但提高了抗坏血酸氧化酶的表达水平;提高了碳酸酐酶活性、蔗糖含量和还原性抗坏血酸含量,并降低了抗坏血酸过氧化物酶活性。表明SOC1可能通过影响叶片抗坏血酸库的氧化还原状态而提高碳酸酐酶活性和光合速率。      

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。     

烟草NtMHX1和NtMHX2基因的克隆及不同金属离子胁迫下的表达模式分析

[目的]研究Magnesium proton exchangers (MHX)基因在烟草(Nicotiana tabacum)中的特性与功能.[方法]采用同源克隆方法,从栽培烟草K326中克隆MHX基因,对其编码蛋白进行了生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测MHX基因在不同烟草组织及金属离子处理0d、1d、2d、...     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

烟草NtGCN2启动子的克隆及功能研究

[目的]探究烟草蛋白激酶NtGCN2启动子驱动GUS基因在ABA、SA、AZA和MeJA四种处理下的表达模式.[方法]克隆烟草NtGCN2上游2000bp的启动子序列,并采用Plant CARE和PLACE数据库进行顺式作用元件预测.构建NtGCN2启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合表达载体并转化烟草K32...     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.5基因的克隆及功能分析

【背景和目的】低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1家族基因在植物吸收和转运硝态氮过程中发挥重要作用,为研究烟草NRT1家族基因在烟草氮素利用中的作用。【方法】从栽培烟草品种K326中克隆获得NtNRT1.5的全长cDNA序列,利用生物信息分析、qRT-PCR技术和转基因技术系统分析NtNRT1.5基因的序列特征、表达模式及在提高烟草氮素利用效率方面的功能。【结果】NtNRT1.5全长序列包含1800bp开放阅读框、编码599个氨基酸,编码的蛋白质具有NRT基因家族的共有结构特征,与拟南芥AtNRT1.5相似性达到59.28%。亚细胞定位结果表明NtNRT1.5蛋白定位在细胞膜上,其启动子中包含多个与硝酸盐（A(C/G)TCA）、胁迫（MYB）、根系特异表达（ROOT MOTIF BOX）相关的响应元件。表达模式分析结果表明NtNRT1.5主要在根部表达,其次是衰老叶片和茎,新叶基本不表达;低氮抑制其在根系中的表达,说明NtNRT1.5主要负责正常条件下的硝酸盐的吸收;低氮条件下,NtNRT1.5过表达显著提高了转基因烟株的氮素利用率。【结论】NtNRT1.5基因在烟草氮素的吸收和转运上行使重要...     

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。      

普通烟草生长素抑制因子NtIAA17的克隆与功能分析

  背景和目的  盐胁迫会抑制作物的生长发育, 从而影响作物的产量和品质。生长素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)蛋白是响应生长素信号的关键因子, 参与调控植物的生长发育和响应非生物胁迫。  方法  为了研究烟草生长素反应基因NtIAA17在烟草生长发育过程中的功能, 以烟草K326为试验材料, 通过克隆获得烟草NtIAA17基因, 利用生物信息学分析其序列特征, qRTPCR技术分析NtIAA17在烟草不同组织及盐胁迫处理0~12 h的表达模式, 利用转基因技术获得过表达NtIAA17-OX(NtIAA17-overexpression)转基因烟草, 对其进行响应盐胁迫的功能鉴定。  结果  NtIAA17基因片段为624 bp, 编码207个氨基酸; 相对分子质量为23.07 kD, 理论等电点为8.24, 该基因启动子区含有顺式作用元件与激素及胁迫相关; 具有Aux/IAA家族蛋白的四个结构域(I-IV)和保守序列。NtIAA17基因与菠菜生长素抑制基因MoIAA13亲缘关系最近; 亚细胞定位分析表明, NtIAA17蛋白是核定位蛋白。qRT-PCR结果表明, NtIAA17基因在茎和老叶中高表达, 盐胁迫2 h时表达量最高。在盐胁迫条件下, NtIAA17-OX转基因烟草与野生型相比, 生物量显著增加, 脯氨酸含量积累增加, 而MDA含量减少, 抗氧化酶基因NtSOD、NtPOD表达量增加。  结论  NtIAA17基因可以响应盐胁迫信号, 通过提高转基因烟草的抗氧化性来抵御盐胁迫带来的伤害, 增加植株的生物量; 本研究为后续耐盐胁迫分子育种提供候选基因和理论依据。      

烟草硝酸还原酶基因NIA1启动子互作蛋白的筛选

硝酸还原酶是植物氮同化过程中的关键酶和限速酶。为更好地调控硝酸还原酶基因的表达,本实验克隆了烟草硝酸还原酶基因NIA1上游938bp的启动子区域,构建了烟草cDNA基因表达文库,应用酵母单杂交技术筛选NIA1启动子序列互作蛋白。通过序列测定和生物信息学分析,共筛选出9个互作蛋白cDNA。其中,功能不明确的预测蛋白7个,具有明确功能信息的蛋白2个,分别为含有CRM结构域的CFM3蛋白（No.71）,和烟草亚硫酸盐氧化酶类似蛋白Sulfite oxidase-like蛋白（No.126）。这些蛋白均为NIA1启动子序列互作蛋白,可能作为转录因子参与NIA1基因的转录调控过程。      

烟草祖先种及重要野生种PDR1基因的生物信息学分析

植物的多向耐药性（Pleiotropic drug resistance, PDR）转运蛋白隶属于ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族的G亚家族。该类蛋白参与植物多种初生、次生代谢物的跨膜运输,在植物的生长发育、响应逆境胁迫、解毒过程中起着重要作用。近年的研究还表明,该蛋白与多种植物对真菌病原的抗性有关。本文以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥PDR12蛋白、烟草的PDR1基因为探针,通过搜索同源序列,从数据库中提取烟草及祖先种、重要野生种中的PDR基因、蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构、功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以本氏烟（Nicotiana benthamiana）NbPDR1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以普通烟草（Nicotiana tabacum）NtPDR1基因为例,预测了其基因编辑位点。结果表明,这些PDR基因相似性高,均编码跨膜蛋白,具有典型的跨膜结构域和核酸结合结构域。该基因启动子区有多个与病原真菌诱导、干旱等逆境胁迫响应相关的元件,暗示该基因可能是抗真菌病害、响应逆境胁迫的广谱抗性基因。最后,本文预测的基因编辑位点,为烟草PDR基因的功能研究、基因编辑及抗病育种提供理论基础。      

CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

普通烟草GATA转录因子家族鉴定及基因表达分析

GATA转录因子在调控植物的生长发育和逆境胁迫应答等过程中具有重要作用。为了明确烟草中GATA基因的结构与功能,基于同源搜索和结构域鉴定的方法从普通烟草基因组中鉴定出57个GATA基因家族成员,分别命名为NtGATA1~NtGATA57。基因结构、保守结构域和系统进化的生物信息学分析表明:烟草GATA基因家族成员可分为4个亚族,且同一亚族成员核心结构域氨基酸序列组成非常保守,各基因成员的外显子数目在1~17之间。转录组数据分析表明:大多数NtGATA基因在烟叶衰老的不同时期均有表达,而且不同家族成员的表达模式存在差异;实时荧光定量PCR分析发现:10个NtGATA基因对冷、盐和干旱等非生物胁迫存在不同程度的响应。说明烟草GATA基因家族成员在烟叶成熟衰老及逆境响应过程中可能发挥了重要作用。