烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的克隆及组织表达谱

为揭示牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)小亚基在烟草(Nicotiana tabacum)中的生理功能,采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到1个牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的cDNA序列,命名为NtGGPPS5(GenBank登陆号:KF316932)。该基因全长1320 bp,编码332个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum,XP_004246572)及其野生种(Solanum pennellii,ADZ24721)的GGPPS小亚基的氨基酸序列一致性均为92%,具有一个特征性的异戊二烯合成酶保守的天门冬氨酸富集区。进化分析表明,植物GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS5属于小亚基。实时荧光定量PCR试验表明,NtGGPPS5基因在烟草根、茎、叶和芽中均有表达,表达量为芽叶茎根。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析

采用RACE技术,从烟叶中克隆了一个新的编码GGPPS蛋白的基因,命名为Ntggpps3,并对其进行了生物信息学分析。Ntggpps3的cDNA序列为1251 bp,包含一个长度为1092 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。NtGGPPS3蛋白与其他植物GGPPSs高度保守。生物信息学预测结果表明,NtGGPPS3的分子量为39.5 kD,等电点为6.28,为亲水性蛋白,N端有叶绿体信号肽。二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成,三级结构含有两个富含天冬氨酸的区域,并通过同源建模构建了NtGGPPS3的3D模型。进化分析表明,植物的GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS3属于大亚基。     

烟草NtGGPPS4基因的克隆和功能初步分析

为明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Nt GGPPS4的功能,从普通烟草中克隆到该基因,构建了超量表达载体p CAMBIA1300-Nt GGPPS4,并通过农杆菌介导法转化烟草。进一步测定了转基因烟株中西柏烷二萜醇和质体色素的含量。结果表明:共鉴定出4株Nt GGPPS4表达量明显升高的转基因植株,且转基因植株中α-西柏三烯二醇(α-cembrenediol,α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-cembrenediol,β-CBD),以及新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素等6种质体色素含量都有显著提高。表明Nt GGPPS4参与了烟草西柏烷二萜醇和类胡萝卜素的生物合成。     

利用VIGS技术研究NtbHLH93基因在烟草甾醇代谢中的功能

为进一步研究烟草NtbHLH93基因的功能,利用病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silence,VIGS)技术降低烟草中NtbHLH93基因的表达。通过测定pTRV2-NtbHLH93烟株中的甾醇含量,发现NtbHLH93基因表达下调后,总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇的含量显著降低。转录组测序发现NtbHLH93基因下调后,共有259个基因差异表达。对这些差异表达基因进行KEGG表达通路分析,发现质体萜类代谢2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate, MEP)途径中有两个基因(Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1)上调表达,这两个基因与MEP途径中的牻牛儿基牻牛儿基还原酶(Geranylgeranyl diphosphate synthases, GGPPS)基因序列高度相似,推测当甾醇合成代谢通路受阻后导致Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1基因上调表达。     

普通烟草KCS基因家族的鉴定及非生物胁迫表达模式分析

【目的】为探究烟草KCS基因在非生物胁迫下所起的作用。【方法】采用生物信息学方法对烟草KCS基因进行系统进化、共线性和表达模式等分析。【结果】从普通烟草中鉴定出41个KCS基因;拟南芥和新鉴定的烟草KCS基因可划分为8个亚组,大部分亚组均含拟南芥和烟草成员;10个NtKCS成员源自全基因组复制事件,NtKCS10和NtKCS11是AtKCS02的同源基因,可能具有相似的生物学功能;普通烟草KCS基因启动子含多个与胁迫相关的顺式作用元件,其成员的表达具有一定的组织特异性;在盐和干旱胁迫下,NtKCS09、NtKCS11和NtKCS16表达量均有提高,可能参与烟草胁迫响应等信号传导过程。【结论】本研究对普通烟草KCS家族成员进行了系统的鉴定与分析,为深入研究烟草KCS家族基因的生物学功能奠定理论基础。     

普通烟草GATA转录因子家族鉴定及基因表达分析

GATA转录因子在调控植物的生长发育和逆境胁迫应答等过程中具有重要作用。为了明确烟草中GATA基因的结构与功能,基于同源搜索和结构域鉴定的方法从普通烟草基因组中鉴定出57个GATA基因家族成员,分别命名为NtGATA1~NtGATA57。基因结构、保守结构域和系统进化的生物信息学分析表明:烟草GATA基因家族成员可分为4个亚族,且同一亚族成员核心结构域氨基酸序列组成非常保守,各基因成员的外显子数目在1~17之间。转录组数据分析表明:大多数NtGATA基因在烟叶衰老的不同时期均有表达,而且不同家族成员的表达模式存在差异;实时荧光定量PCR分析发现:10个NtGATA基因对冷、盐和干旱等非生物胁迫存在不同程度的响应。说明烟草GATA基因家族成员在烟叶成熟衰老及逆境响应过程中可能发挥了重要作用。      

普通烟草SBP转录因子家族的全基因组鉴定及其进化和表达分析

SBP转录因子家族作为植物特异性的转录因子具有重要的生物学功能,广泛参与花和果实发育等诸多生命过程。利用普通烟草(Nicotiana tabacum)TN90基因组数据,通过隐马尔科夫模型检索,SMART和Pfam分析,鉴定了普通烟草SBP转录因子家族成员;通过多序列比对鉴定并分析了普通烟草SBP结构域的结构特征;通过邻接法、极大似然法进行了系统发育分析;分别利用GSDS和MEME对SBP转录因子家族成员的基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;利用普通烟草TN90转录组数据分析了SBP转录因子家族成员在不同组织和时期的表达情况,并对鉴定出的SBP转录因子家族成员进行了GO注释分析。结果表明,普通烟草基因组编码32个SBP转录因子家族成员,氨基酸序列长度差异较大;系统发育分析表明,所有的SBP转录因子家族成员可分为8个亚家族。转录组数据显示,SBP基因家族成员在不同组织和时期中表达迥异,但在花器官中均有较高的表达量。GO注释结果表明,该家族成员作为转录因子,在植物的生长发育、逆境响应等过程中发挥作用。本研究为烟草及其他植物中SBP转录因子家族基因的鉴定和功能研究提供了基础。     

普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物的多种生命进程中发挥着重要作用。为解析烟草中Dof家族成员在生长发育过程中的潜在作用,本研究利用比较基因组学、进化分析、共线性分析等方法解析烟草中的Dof家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在烟草基因组中共鉴定到69个Dof转录因子,其Dof功能域在进化上十分保守,根据系统进化分析结果将其划分为9个亚家族。共线性分析表明,烟草中的16个Dof基因与拟南芥17个Dof基因有27个共线性基因对,同时,25个Nt Dof基因被检测到存在17个全基因组复制对,表明复制事件在烟草Dof基因家族的扩张中起关键作用。此外,表达模式分析表明Nt Dof基因的表达存在明显的组织特异性,其中NtDof05和NtDof28基因可能与根系生长发育有关。本研究对烟草基因组中的Dof转录因子进行了系统的鉴定和分析,为烟草Dof转录因子家族成员的功能研究奠定了基础。     

烟草GA代谢相关基因ga1和ga2的克隆和表达分析

为了解赤霉素（gibberellic acids, GA）在烟草生长发育中的作用,本研究利用同源克隆和RACE技术分离了3个烟草种GA代谢相关基因ga1和ga2的6条序列,对其进行了序列比对和进化分析;并利用荧光定量表达分析研究了其在林烟草和普通烟草中的表达谱。结果表明,相关基因在烟草属和茄科作物中保守性很高;普通烟草中克隆的ga1和ga2可能起源于绒毛状烟草。表达分析表明,ga1和ga2在林烟草生长发育早期和茎伸长期分别在叶和茎中的表达量显著高于其他组织。     

烟草ACO基因家族鉴定和二氯喹啉酸药害条件下的表达分析

烟草二氯喹啉酸药害是影响我国烟叶原料保障的重要问题之一,药害机制可能与乙烯合成相关。为了明确二氯喹啉酸药害的作用机制,对烟草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase,ACO）基因家族进行鉴定,并对二氯喹啉酸药害条件下的基因表达模式进行分析。结果表明:普通烟草、林烟草、绒毛状烟草分别含有19、9和10个ACO基因。亚细胞定位预测分析显示,几乎所有蛋白均定位于细胞质中。进化分析表明,烟草ACO蛋白家族进化形成三类,Ⅰ类成员最多,Ⅱ类成员最少。MicroRNA靶点分析发现,普通烟草6个ACO含有潜在的miRNA靶点。启动子分析表明,普通烟草ACO启动子区含有激素反应、低温反应、抗性和胁迫反应等多种类型的顺式作用元件。二氯喹啉酸处理下的基因表达分析显示,普通烟草ACO家族所有成员均受二氯喹啉酸诱导上调表达,Ntab0263610、Ntab0263620、Ntab0220530和Ntab0220520 4个基因的上调幅度最大,推测这些基因在烟草二氯喹啉酸药害引起的乙烯合成中发挥关键作用。      

绒毛状烟草钙依赖蛋白激酶基因家族分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)是一个多基因家族,在植物的钙信号转导中具有重要作用。以拟南芥、普通烟草和烟草属其他种中已知的CDPK序列检索绒毛状烟草基因组框架图数据库,获得绒毛状烟草CDPK基因,并对其进行基因结构、GC含量、系统进化关系、主坐标和基因表达谱分析。结果表明：共分离获得25个绒毛状烟草CDPK基因,它们均具有完整的开放读码框;系统进化树和主坐标分析证实这25个CDPK分布于4个亚家族中;RT-PCR分析显示,绒毛状烟草CDPK基因家族的空间表达存在明显的差异性。此为进一步阐明CDPK基因家族在烟草的钙信号转导过程中的功能及分子机制奠定了重要基础。     

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

普通烟草钙依赖蛋白激酶NtCDPK15的基因克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)对Ca²⁺信号转导通路下游元件的调控具有重要作用。本实验采用同源克隆技术从普通烟草中分离得到1 个CDPK 基因,命名为NtCDPK15(GenBank 登录号为JN662020),cDNA 全长为1963 bp,ORF 大小为1569 bp,编码522 个氨基酸。多序列比对结果表明,NtCDPK15 的编码产物具有典型的CDPK 保守序列,C 末端调控区有4个EF 手性结构。系统进化树分析显示,NtCDPK15 可能来源于绒毛状烟草,预测NtCDPK15 与NtCDPK1这对旁系同源基因在功能上可能非常保守。实时荧光定量PCR 分析结果表明,NtCDPK15 在根和叶中的表达量显著高于茎中的表达量,但经盐胁迫诱导后NtCDPK15 在茎中的表达量显著增加,同时,盐胁迫还使基因在叶中的表达量显著上调,ABA 胁迫可诱导基因在根中的表达,而干旱胁迫可使基因在根和叶中的表达量下调,这些结果说明NtCDPK15 在普通烟草中的表达受盐胁迫及ABA 胁迫诱导,但受干旱胁迫抑制。     

烟草脱落酸受体基因NtPYR1和NtPYL9的克隆及表达模式分析

为揭示烟草脱落酸(ABA)受体基因NtPYR1和NtPYL9的生物学功能,以拟南芥PYR1和PYL9基因为探针,在NCBI中通过同源比对查找普通烟草表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)序列,将EST序列进行拼接并设计特异性引物,从普通烟草红花大金元c DNA文库中克隆出NtPYR1和NtPYL9基因,其开放阅读框长分别为678 bp和564 bp,分别编码225个和187个氨基酸。NtPYR1和NtPYL9蛋白都具有一个保守的疏水性结构域,同属于PYR/PYL/RCAR ABA受体基因家族,NtPYR1和NtPYL9与番茄同源蛋白的相似性分别达到79.10%和95.24%。遗传聚类分析结果显示:NtPYR1和NtPYL9与番茄和马铃薯同源基因的遗传进化距离最近,说明PYR1和PYL9在茄科植物中较为保守。定量PCR对烟草不同组织表达模式分析表明,NtPYR1和NtPYL9在烟草不同组织中均有表达,分别在子叶和须根中的表达量最高。NtPYR1和NtPYL9表达均受ABA抑制,同时受H₂O₂诱导,说明两基因可能参与烟草的抗逆生理过程。      

烟草细胞质雄性不育线粒体基因sdh3和sdh4的生物信息学分析

线粒体基因异常可能导致烟草细胞质雄性不育。sdh3、sdh4是编码线粒体电子传递链复合体II 亚基的重要基因,为探讨线粒体基因sdh3、sdh4与细胞质雄性不育的关系,从3 个普通烟草不育系品种及其保持系中提取线粒体DNA,根据GenBank 报道的烟草线粒体DNA 序列设计特异引物扩增目的基因并克隆测序,应用生物信息学方法,分析烟草雄性不育系及保持系的sdh3、sdh4基因在其核苷酸、编码蛋白各结构层次上存在的差异。结果显示,不育系的sdh4基因第28 位碱基发生了改变;不育系的sdh3基因发生10 个碱基的缺失,以致其编码蛋白改变,这极可能成为干扰线粒体琥珀酸脱氢酶亚基3 功能的关键因素,从而成为可能导致烟草CMS 的根本原因之一。