聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取葡萄糖氧化酶的研究

采用聚乙二醇/硫酸铵[PEG/(NH4)2SO4]双水相体系对葡萄糖氧化酶的萃取进行了研究。以双水相系统的上、下相的酶活、比酶活、相比R、分配系数K和萃取率Y等为参数,探讨了PEG质量分数、不同PEG浓度和不同硫酸铵浓度对葡萄糖氧化酶在PEG/(NH4)2SO4双水相系统中分配行为的影响。实验结果表明:葡萄糖氧化酶在25%的PEG4000和10%硫酸铵的双水相体系中可获得较高的萃取率达81.11%,分配系数为0.134。     

木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe~(3+)/(NH_4)_2SO_4双水相体系中亲和分配行为研究

目的:研究木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO4亲和双水相体系中分配行为。方法:采用浊点法,构建双水相相图,考察各成相剂对木瓜蛋白酶活性的影响;研究不同PEG4000和(NH4)2SO4的质量分数、不同PEG-IDA-Fe3+的取代量时,木瓜蛋白酶在两相体系中分配行为的变化;用响应面法优化亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分离条件;同时对木瓜蛋白酶在萃取体系中的结构进行表征。结果:当两相体系中p H6.9,PEG4000质量分数16%,(NH4)2SO4质量分数20%,PEG-IDA-Fe3+为3%时,木瓜蛋白酶的上相酶活性回收率达90.5%,蛋白分配系数达1.85,而其在PEG/(NH4)2SO4中的酶活回收率及蛋白分配系数都低于PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO4亲和双水相体系。结论:PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO亲和双水相系统能有效提高木瓜蛋白酶的分配效果,采用Fe3+螯合PEG成相剂的双水相萃取木瓜蛋白酶条件温和,不影响酶的特征结构。     

聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取α-葡聚糖酶

采用聚乙二醇-硫酸铵(PEG-(NH4)2SO4)双水相体系对α-葡聚糖酶进行萃取,以两相比、酶活、蛋白浓度、比活力以及萃取率为参数进行比较,探讨了使用不同分子量的PEG、不同的PEG浓度以及不同(NH4)2SO4浓度下对酶分配行为的影响。实验结果表明,α-葡聚糖酶在质量分数13%的PEG4000以及13%的(NH4)2SO4的双水相系统中,可获得较高的比活力2364.97 U/mg以及萃取率99.94%。     

双水相法萃取分离猪胰α-淀粉酶体系的初步研究

采用聚乙二醇(PEG1500)/硫酸铵[(NH4)2SO4]双水相体系对猪胰α-淀粉酶分离条件进行了研究。探讨PEG质量分数、p H值和(NH4)2SO4质量分数对猪胰α-淀粉酶在PEG1500/(NH4)2SO4双水相中的分配系数Ka及萃取率Y的影响,并通过正交试验优化双水相萃取条件。结果表明,在p H值为7.0,PEG1500质量分数为18%,(NH4)2SO4质量分数为12%的双水相体系中,α-淀粉酶的分配系数Ka为8.48,萃取率Y为80.25%,α-淀粉酶活为1 690 U/m L。     

双水相体系萃取分离鲍鱼内脏中的β-葡萄糖苷酶

采用聚乙二醇(PEG)/磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)双水相萃取技术对鲍鱼内脏中的β-葡萄糖苷酶进行萃取分离。分别考察PEG分子量、PEG、NaH₂PO₄的质量分数、双水相体系的pH、样品加入量及超声波辅助方法对下相总酶活、纯化倍数及萃取率的影响,并通过单因素实验及正交实验进行优化。结果表明:室温下12% PEG4000+15% NaH₂PO₄双水相组成对粗酶液有最佳萃取效果,目标酶富集于下(盐)相,酶活为1.45 U,萃取率为0.991,分配系数为104,纯化倍数为4.4;该体系自然状态下的pH萃取效果最佳,最大处理量为体系总质量的20%,体系所有组分混匀后超声波180 W处理5 min辅助处理,能略微提高萃取效果。     

无花果蛋白酶在双水相体系中分配行为

双水相萃取(ATPS)是近年来发展起来的新型、廉价酶纯化方法。为了扩展该方法应用领域,对PEG(polyethylene glycol)/(NH4)2SO4 双水相体系萃取无花果叶中无花果蛋白酶的实验条件进行研究,考察PEG 相对分子质量、成相物质量分数、pH 值、温度对无花果蛋白酶在两相体系中分配系数(K 值)的影响。结果表明：当两相体系中PEG 相对分子质量为1000、PEG 质量分数为20%、(NH4)2SO4 质量分数为19%、pH 值为6、温度室温(25℃)时蛋白酶在两相体系中分配系数最高可达3.6。     

韦伯灵芝漆酶的分离纯化及其性质

采用硫酸铵分级盐析、透析、聚乙二醇浓缩和高效液相色谱柱层析从韦伯灵芝TZC-1 发酵液中分离纯化得到电泳纯漆酶,其纯化倍数为37.1 倍,酶活性回收率为21.3%。活性-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果表明该漆酶由一种同工酶组成,纯化漆酶经SDS-PAGE 检测显示为单一条带,其分子质量约为40kD。该漆酶催化底物ABTS 的最适反应温度为50～60℃,最适反应pH 值为4.6,在60℃以下和pH3.0～5.0 范围内保持稳定,以ABTS为底物的表观Km 值为13.8μmol/L。Fe2+ 完全抑制酶活,Al3+ 和Mn2+ 对该漆酶也有明显抑制作用,Hg+、Cu2+ 和Mg2+ 对该酶有明显激活作用,而Zn2+、Ba2+ 及K+ 对该酶活性影响不大。     

聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取猪胃蛋白酶工艺研究

采用聚乙二醇/硫酸铵[PEG/(NH4)2SO4]建立稳定的双水相体系以分离猪胃蛋白酶。通过上下相体积比(VR)、比活力(SA)、纯化因子(PF)、酶活回收率(η)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析测定萃取效果。结果表明,萃取猪胃蛋白酶的最佳配比体系为25%PEG1000:18%(NH4)2SO4,所萃取的猪胃蛋白酶酶活回收率为91.5%,SDS-PAGE结果显示,萃取的蛋白质和猪胃蛋白酶对照品分子量大小一致。     

响应面法优化黑豆酯酶的双水相萃取工艺

采用双水相萃取技术对黑豆酯酶进行分离纯化,优化黑豆酯酶在聚乙二醇4000/硫酸铵双水相体系中的分配行为。首先,制作PEG4000/(NH4)2SO4双水相相图;然后考察PEG4000质量分数、(NH4)2SO4质量分数、萃取体系p H值3个因素对黑豆酯酶萃取率的影响;最后采用Box-Behnken中心组合试验设计对黑豆酯酶双水相萃取工艺进行优化,确定最佳工艺条件为:PEG4000质量分数为28%、萃取体系p H为7.30、(NH4)2SO4质量分数为17%。此条件下黑豆酯酶萃取率为(93.95±0.24)%,黑豆酯酶酶比活力达到7.893 U/mg。与粗酶液纯度相比,黑豆酯酶双水相萃取工艺提纯倍数为7.363倍。该结果为黑豆酯酶的提纯和进行有机磷农药残留的检测提供科学依据。     

两步盐析联合双水相萃取提取纯化蓝藻中藻蓝蛋白

以巢湖新鲜蓝藻为处理对象,采取冻融破壁的方式获取藻蓝蛋白的粗提液,采取两步盐析联合双水相萃取的方法提取纯化藻蓝蛋白。运用0.618法选点实验研究了两步盐析中(NH4)2SO4饱和度对提取纯化影响,构建了聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）-(NH4)2SO4的双水相体系,综合考虑PEG相对分子质量、PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值和藻蓝蛋白质量浓度对提取纯化藻蓝蛋白的影响。结果表明：室温25 ℃条件下,一步盐析时(NH4)2SO4的最佳饱和度为21%,二步盐析时(NH4)2SO4的最佳饱和度为30%。两步盐析后得到的藻蓝蛋白构建成PEG-(NH4)2SO4的双水相体系后,当PEG相对分子质量1 000、PEG 1 000质量分数10%、(NH4)2SO4质量分数25%时,藻蓝蛋白的纯度可达3.45。     

PEG/（NH4）2SO4双水相体系萃取果胶酶

采用PEG/(NH4)2SO4双水相系统对果胶酶进行萃取分离,研究了PEG分子量、pH、成相物质浓度、NaCl浓度、温度等因素对果胶酶分配系数的影响,结果表明:双水相体系质量组成为PEG100027%,(NH4)2SO419%,NaCl0.002%,pH5.0时果胶酶的萃取效率较好,实验中分配系数最高可达为14.0。     

低温果胶酶的纯化及酶学性质的研究

进行了低温果胶酶产生菌的筛选,并对低温果胶酶的酶学性质、纯化及动力学常数进行了研究。结果表明:该酶最适酶反应温度25℃,最适酶反应pH为5.8;酶液的pH稳定范围在5～6.4;在25℃保温3h,酶活降至50.5%,在35℃保温2h,酶活降至55.1%,在45℃保温1.5h,酶活降至48.7%,在55℃保温1h,酶活降至43.1%;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用,而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用;当以果胶为底物时,该酶的动力学常数Km为27.86mg/mL,Vmax为152.13μmol/(min·mL);采用不同的处理方法均可使低温果胶酶得到纯化,但40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好。     

双水相萃取分离米曲霉中性蛋白酶

采用聚乙二醇(PEG)/盐双水相体系萃取分离米曲霉中性蛋白酶。探讨了不同成相盐及其浓度、成相聚合物PEG及其浓度、pH和NaCl浓度对中性蛋白酶萃取的影响。结果表明,适宜的双水相萃取体系为20%PEG1000/25%(NH4)2SO4(m/m)、pH8.0、不添加NaCl,此条件下中性蛋白酶上相酶活回收率和纯化倍数分别为99.88%和2.32。     

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质的研究

对灰轮丝链轮丝菌ZC60所产生的谷氨酰胺转胺酶采用(NH4)2SO4盐析、透析脱盐、冷冻浓缩和SephadexG-100凝胶过滤层析进行纯化,经SDS-PAGE检测,样品达到电泳级纯。对冷冻浓缩后得到的粗酶的酶学性质进行研究,得到该酶的最适反应温度为50℃,最适pH为7.0;酶的温度稳定范围为0～50℃,pH稳定范围为6.0～7.5;K+、Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+对MTG的活性几乎没有影响,而Pb2+,Cu2+抑制酶活。     

PEG/(NH4)2SO4双水相相图制作新方法的研究

以PEG4000/(NH4)2SO4和PEG6000/(NH4)2SO4双水相系统为研究对象,研究了双水相相图制作的新方法--用直接电导法测出双水相体系上下两相中(NH4)2SO4的质量分数,用碘沉淀法测出上下两相中PEG的含量,并对改进方法的准确度进行了考察.结果表明,PEG4000和PEG6000的最大吸收峰分别为517.6nm和515.8nm.经可行性实验验证,(NH4)2SO4理论值-检测值与PEG理论值-检测值之间无显著性差异.     

响应面分析法优化麦麸酯酶双水相萃取的条件

研究采用聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取麦麸酯酶,通过单因素实验考察不同PEG分子量、PEG浓度、无机盐种类、无机盐浓度、pH和离子强度对麦麸酯酶总蛋白分配系数、酶活回收率、纯化倍数的影响,并通过响应面分析法优化了萃取条件。结果表明最佳萃取条件为:PEG1000质量浓度为21%、(NH4)2SO4质量浓度为18%、pH4.4。回归方程预测双水相萃取纯化倍数可达到2.9208,三次验证实验的平均纯化倍数为2.9190,与预测值相对误差为0.06%。     

双水相法萃取生姜蛋白酶体系的建立

以生姜为原料,研究了采用双水相萃取技术分离提取生姜中生姜蛋白酶的提取条件,利用单因素试验与正交试验进行优化,优化得到的萃取方案为:PEG分子质量为4 000 u,PEG浓度为30%,选择盐种类为(NH4)2SO4,浓度为10%,体系pH为8.0。此双水相体系的生姜蛋白酶上相酶活力回收和纯化倍数都最高,分别可达393.77%和1.85。     

副溶血弧菌C20褐藻胶裂解酶的纯化及酶学特性研究

副溶血弧菌C20发酵液经离心,超滤浓缩,盐析,DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephardex G-100分离纯化得到电泳纯的褐藻胶裂解酶,其分子量为40 kD.酶的最适温度为30℃,在此温度下保温3.5 h,相对酶活仍保持在90%;酶的最适pH为7.2,在pH 7.0～7.6范围内稳定;Mg2 、Na 、NH4 、Ca2 、甲醇和适量浓度的Tween-80对酶有激活作用;Zn2 、Cu2 、Fe2 、Al3 、乙醇、丙三醇、DTT、尿素和SDS等对酶有较强的抑制作用;此褐藻胶裂解酶对聚古罗糖醛酸有很强的底物专一性,其Km值为1.38 mg/mL,Vmax为0.052 mg/(mL(min).     

废弃食用菌栽培块中纤维素酶的提纯工艺研究

利用废弃食用菌栽培块通过浸提、膜浓缩、盐析和双水相萃取等方法提取加工工业级和高纯度纤维素酶制剂。结果表明：采用含体积分数0.2% Triton X-100 的pH5.0、0.2mol/L 乙酸- 乙酸钠缓冲液作为酶浸提液,在25℃浸提3h 条件下可以抽提出102.64U/mL 的纤维素酶溶液,再在质量分数60% 的(NH4)2SO4 饱和度条件下可回收65.54% 的纤维素酶总活力,制备成酶活力达到2865.47U/mL 的工业级纤维素酶制剂;再经质量分数22% 聚乙二醇6000(PEG6000)-20%(NH4)2SO4 双水相体系在pH5.5、7mmol/L NaCl 条件下常温萃取,可获得酶活力为10208.46U/mL,酶比活力106.62U/mg 的高纯度纤维素酶,酶总活力得率为51.22%,纯度是浸提液的12.85 倍。     

皱胃酶酶学性质的研究

研究了皱胃酶的酶学性质。皱胃酶的最适作用温度和最适pH值分别为42℃和6.0。在45℃以下和pH4.5～7.0范围内,酶活保持稳定。Ca2+、Na+、Fe3+对皱胃酶的凝乳有明显的促进作用,Mg2+、Cu2+、Ba2+对凝乳有抑制作用。并研究了底物浓度对酶反应的影响。