新型还原酶的挖掘与设计及手性醇的制备

为了解决生物催化制备手性化合物用催化剂需求的不足、还原酶催化过程存在酶活性低和底物浓度限制的问题。基于基因挖掘技术和还原酶保守序列分析,经筛选和设计获得了新型还原酶SDR05;采用单因素实验和Box-Behnken法,构建了表达还原酶SDR05的重组菌不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮(BTAP)制备相应手性醇的反应体系。结果表明,重组菌在以体积分数为69%异丙醇、3.9 mmol·L^-1氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)、1mmol·L^-1MgCl₂、300 g·L^-1重组菌、3 000 mmol·L^-1 BTAP和pH为7.4磷酸缓冲液组成的反应体系和32℃、150 r·min^-1条件下催化反应18 h,产物产率和对映体过量值分别为98.3%和99.9%。研究结果丰富了还原酶库,实现BTAP底物在高质量浓度下的转化,为工业化制备(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇等手性化合物奠定基础。     

链霉菌FJS31-2 abxR2基因克隆表达及蛋白纯化

利用原核表达系统获得链霉菌FJS31-2 AbxR2重组蛋白,并进行纯化。通过PCR扩增abxR2基因,将扩增产物克隆至pET32a质粒上构建重组质粒pET32a-abxR2;将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达,并通过尿素洗涤方式对AbxR2重组蛋白进行纯化。酶切和测序结果均证实重组质粒pET32a-abxR2构建成功;在菌液OD₆₀₀值为0.6、28℃、110 r·min^-1、1.0 mmol·L^-1 IPTG诱导4 h时,AbxR2重组蛋白的表达效果较好;采用尿素洗涤方式纯化AbxR2重组蛋白,可得到单一特异蛋白条带,效果较好。为研究AbxR2蛋白的结构和功能及提高Zunyimycins产量奠定了基础。     

烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉（A.fumigatus）为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌（Ther-momicrobium roseum）DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a（＋）-kstDF表达载体,转化大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21（λDE3）,获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温（37℃）有利于KstDF蛋白表达,低温（20℃）有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。     

卡拉胶酶高产菌株YDK-6的筛选、产酶条件优化及酶学性质研究

从腐烂的角叉菜中筛选出卡拉胶酶高产菌株YDK-6,通过形态观察及16S rDNA序列分析对其进行鉴定,采用正交实验对其产酶条件进行了优化,并对其所产卡拉胶酶的酶学性质进行了研究。结果表明,菌株YDK-6为假单胞菌(Pseudomonas sp.);在葡萄糖加量为15 g·L^-1、酵母粉加量为10 g·L^-1、卡拉胶加量为2 g·L^-1、NaNO₃加量为2 g·L^-1、NaCl加量为15 g·L^-1、K₂HPO₄加量为1.00 g·L^-1、MgSO₄加量为0.05 g·L^-1、FePO₄加量为0.01 g·L^-1、CaCl₂加量为0.01 g·L^-1、起始pH值为7.5的条件下,于28℃摇床培养72 h,所产卡拉胶酶的活力达到111.33 U·mL^-1<...     

高效液相色谱法测定甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂中间体3-异色酮的质量分数

针对目前国内暂无对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂活性基团的重要合成中间原料 3-异色酮检测方法的相关研究及报道,本试验建立了一种测定 3-异色酮质量分数的检测方法。采用高效液相色谱仪,以乙腈-超纯水为流动相,使用 ODS-SP 为填料的不锈钢色谱柱和二级阵列管检测器,在 210 nm 波长下对合成甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂重要中间体 3-异色酮进行分离和定量分析。当 3-异色酮的质量浓度在 0.5～20 mg·L^-1时,分析方法的线性关系良好,相关系数 R²为 0.999,检出限为 3.55×10^-1 mg·L^-1,定量限为 1.18 mg·L^-1,土壤和水体中加标回收率均在 80%以上。该检测方法分离效果好,线性关系、精密度和回收率均符合要求,可作为 3-异色酮环境安全性评价时的质量分数测定方法,也可用于农药合成和生产环节的质量控制方法。     

响应面法优化泡盛曲霉产抗肿瘤活性物质发酵工艺

为提高喜树内生真菌发酵产10-羟基喜树碱(10-hydroxyamptothecin, HCPT)能力,以泡盛曲霉CS24为发酵菌种,以HCPT产量为考核指标,通过单因素实验和Plackett-Burman实验,筛选出发酵温度、通风量和玉米浆干粉含量等3个影响发酵的显著因素;通过最陡爬坡实验确定中心组合设计的水平中心;通过Box-Behnken实验、响应面分析获得最优培养基为：玉米浆干粉13 g·L^-1、花生饼粉25 g·L^-1、蔗糖10 g·L^-1、糊精30 g·L^-1、麦芽糖15 g·L^-1、Mg²⁺ 0.5 mmol·L^-1;最优发酵工艺为：发酵温度29℃、通风量0.6 vvm、搅拌转速380 r·min^-1、初始pH值5.0。在此条件下,HCPT产量达到171.6 mg·L^-1,比优化前(94.6 mg·L^-1)提高了44.9%,为工业化发酵生产HCPT奠定了理...     

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD)的构建及其转化甘油

利用温控载体pHsh将编码甘油脱水酶的基因dhaB和编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD串联构建重组质粒pHsh-dhaB-yqhD, 将其转化大肠杆菌得到新型产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD), 并对影响该重组菌发酵的营养因子进行研究.实验结果表明：该重组菌转化甘油合成1,3-丙二醇的适宜培养基组成为甘油60 g·L^-1、酵母膏5.0 g·L^-1、维生素B₁₂ 0.05 g·L^-1以及KH₂PO₄ 7.5 g·L^-1; 以此培养基在5 L发酵罐上进行放大, 1,3-丙二醇产量、转化率和生产能力分别达到43.26 g·L^-1、72.2 %和1.55 g·L^-1·h^-1.     

杜仲中环烯醚萜类物质对性激素转化的调控作用

杜仲是中国传统名贵滋补药材,有补益肝肾、强筋壮骨、固经安胎的功效,而这些功效与性激素水平息息相关,故本文研究了杜仲中3种主要的环烯醚萜类物质（京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸）对性激素的转化作用。以卵巢颗粒细胞的肿瘤细胞系KGN作为激素的转化系统,孕烯醇酮为转化底物,分别测量环烯醚萜类物质干预24h后培养基中的孕酮、睾酮以及雌二醇的浓度,并提取细胞的RNA,以反转录实时荧光定量法来研究其催化酶3β-HSD、CYP17A1以及17β-HSD表达水平的影响。研究结果表明,50 μmol/L的京尼平能显著提升3β-HSD、CYP17A1以及17β-HSD的表达水平,从而显著促进睾酮和雌二醇的合成。     

双相镁锂合金表面磷酸盐化学转化膜的制备及性能研究

以磷酸氢二铵、硝酸钙、十二烷基硫酸钠、磷酸组成磷酸盐转化液,采用正交实验法在不同浓度组成的转化液中分别制备镁锂合金磷酸盐化学转化膜,对比研究组分浓度对镁锂合金表面磷酸盐化学转化膜耐蚀性的影响。实验结果表明：合金在转化液组成配比为15 g·L^-1 (NH₄)₂HPO₄、35 g·L^-1Ca(NO₃)₂·4H₂O、0.6 g·L^-1 C₁₂H₂₅NaSO₄时形成的磷酸盐化学转化膜耐腐蚀性能最佳。     

鸢尾生香菌的分离鉴定及鸢尾酮的生物合成

针对传统植物提取法生产鸢尾酮过程中存在的生产周期长、产物得率低、生产成本高等问题,提出以新鲜根粉为原料利用微生物发酵生产鸢尾酮的方法。从鸢尾根茎中筛选得到一株产香细菌,通过细菌16S rDNA基因序列分析确定为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex strain)。使用甘油混合培养基,添加终浓度5 g×L^-1的新鲜根粉为底物,在28℃,200 r×min^-1条件下,发酵24 h顺式α-鸢尾酮摇瓶产量达到315.95 mg×kg^-1。10 L发酵罐放大培养结果表明18 h后顺式α-鸢尾酮产量最高可达到1 037.65 mg×kg^-1,是摇瓶发酵产量的3.28倍。利用微生物发酵生产鸢尾酮,大幅度提高了鸢尾酮的生产效率,对促进鸢尾酮生物合成的工业化应用具有重要意义。     

HPLC法测定福司氟康唑含量及有关物质

采用ODS色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以0.01mol·L^-1的Na H2PO4(pH值为5.5)-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速为1.0m L·min-^-1,柱温40℃,检测波长210nm。福司氟康唑与其中间体二苄酯及起始物料氟康唑均能得到较好的分离。福司氟康唑的定量限为53.93ng·m L^-1,检测限为16.18ng·m L^-1;浓度在0.05～1556.28μg·m L^-1,与峰面积线性良好,r=0.9999;平均回收率为99.28%。氟康唑的定量限为14.49ng·m L^-1,检测限为4.35ng·m L^-1;浓度在0.02～20.70μg·m L^-1与峰面积线性良好,r=0.9998;平均回收率为97.03%。二苄酯的定量限为43.47ng·m L^-1,检测限为13.04ng·m L^-1;浓度在0.04～21.74μg·m L^-1     

晶胶固载副干酪乳杆菌及合成苯乳酸的实验研究

针对生物法合成苯乳酸存在成本高、高产菌株缺乏、工业化困难,稳定性低等问题,利用阴离子交换晶胶对副干酪乳杆菌的吸附作用,在发酵过程中形成复合生物催化剂,用于苯乳酸发酵和转化合成。对复合催化剂微观结构、形成过程特性、发酵和转化性能进行了测定。结果表明:发酵时投入晶胶可形成固载细胞的超大孔复合生物催化剂,不仅促进菌体生长,使生物量达7.10mg×m L^-1,是同条件下无晶胶时的2.5倍,而且通过减轻底物抑制,将苯乳酸产量由0.71 mg×m L^-1提高到0.95 mg×m L^-1;以浓度0.5、1和2 mg×m L^-1的苯丙氨酸为底物,采用复合催化剂转化生成苯乳酸的产量是相应全细胞催化剂时的3、2.5和1.5倍。     

鲎血G因子的原核表达

目的在大肠埃希菌中表达重组鲎血G因子,并检测其酶活性。方法根据大肠埃希菌偏好性优化G因子成熟肽编码序列,将G因子α亚基及β亚基克隆至原核表达载体pET32a-sumo上,分别构建pET32a-sumo/factorG-α及pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达;产物经Ni-NTA亲和层析,SUMO蛋白酶切割融合伴侣,获得重组目的蛋白factorG-α及factorG-β;将二者等摩尔质量重组获得复合物G,荧光底物Boc-Glu-(OBzl)-Gly-Arg-MCA检测其酶活性。结果经PCR及测序鉴定,重组质粒pET32a-sumo/factorG-α及p ET32a-sumo/factorG-β构建正确;表达蛋白均以包涵体的形式存在沉淀中,表达量占菌体总蛋白的30%及45%;纯化的factorG-α及factorG-β蛋白相对分子质量约为74 000和31 000,每1 L LB培养基酶切回收蛋白分别为0. 7和1. 7 mg。factorG-α及factorG-β蛋白与荧光底物几乎不反应,而复合物G可与荧光底物反应产生较高的荧光强度。结论成功表达了具有酶活性的鲎血G因子,为进一步探讨鲎血G因子的生物学功能及新型真菌感染检测试剂盒开发奠定了基础。     

重组酪氨酸脱羧酶酶学性质

酪氨酸脱羧酶能以L-酪氨酸为底物脱羧生成酪胺。该文利用pET28a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了短乳杆菌来源的酪氨酸脱羧酶,并研究了其酶学性质,考察了起始pH、温度、辅酶、底物浓度等因素对酶活的影响。结果表明,酪氨酸脱羧酶重组表达成功,酶促反应工艺为:在1 mL转化液中含有0.18 g L-酪氨酸,0.02 g湿菌体,0.2 mol/L的醋酸缓冲溶液和0.2 mmol/L的5'-磷酸吡哆醛,40℃,pH=5.5,反应7 h,L-酪氨酸的摩尔转化率达到99%。酪氨酸脱羧酶酶活为29.2 U/g,Km值和Vmax为0.71 mmol/L和9.31mol/(L·min·g)。     

牺牲模板剂包裹纳米金颗粒的合成研究

本文介绍了一种牺牲模板剂包裹纳米金颗粒的合成方法。通过对间苯二酚浓度、乙醇浓度、反应温度、反应时间等的考察,得出最优反应条件为氯金酸的浓度为 0.15mmol·L^-1、间苯二酚浓度为 0.03mol·L^-1、甲醛浓度为 8mmol·L^-1、乙醇的浓度为 0.3mol·L^-1、NH₃·H₂O 浓度为 0.1mol·L^-1,反应温度为 30℃,反应时间为 2h,合成的颗粒分散度高,尺寸均匀,粒径约为 60nm。     

2-烯-甘草次酸酯及其脱氧化合物的合成与抗肿瘤活性研究

以18β-甘草次酸为起始原料,经C11位羰基还原、C30位羧基酯化、C3位羟基取代和消除等反应,合成了一系列2-烯-甘草次酸酯(Ⅳ)和2-烯-11-脱氧甘草次酸酯(Ⅷ),通过IR、¹HNMR、ESI-MS对其结构进行了表征,并采用MTT法测定了其对人宫颈癌细胞(HeLa)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(BGC-823)的抑制活性。结果表明,化合物Ⅳa、Ⅳd、Ⅷa、Ⅷd对HeLa、HepG2、BGC-823细胞均有一定的抑制活性,尤其对HeLa细胞具有较强的抑制活性,IC₅₀值分别为8.13μmol·L^-1、7.87μmol·L^-1、10.7μmol·L^-1、9.43μmol·L^-1。     

基于3D-COF的SPME纤维的制备并应用于苯乙胺和酪胺的检测

本论文一种具有金刚石拓扑结构的三维共价有机骨架(COF-DL229)与环氧树脂的复合物涂覆于不锈钢基底,制备了一种纤维型固相微萃取器,并与气相色谱-质谱法联用,建立了水基质中苯乙胺和酪胺的检测方法。与商品化的SPME纤维相比,COF-DL229萃取器对苯乙胺和酪胺的萃取效率具有显著的优势。在优化后的SPME条件下,上述建立的检测方法对苯乙胺和酪胺的线性范围分别为10～500μg·L^-1和10～1000μg·L^-1;检出限分别为0.01μg·L^-1和1μg·L^-1,日内相对标准偏差为8.47%～10.04%,日间相对标准偏差为11.32%～14.95%。     

5-氯水杨醛-罗丹明B荧光探针的合成及其识别性能研究

以水合肼、5-氯水杨醛和罗丹明B为原料,合成了5-氯水杨醛-罗丹明类衍生物探针L,目标化合物5-氯水杨醛罗丹明B联肼经核磁、红外光谱和质谱进行了表征,采用紫外光谱法和荧光光谱法研究了其与金属离子的识别性能。结果表明,该探针可选择性紫外识别Cu²⁺和荧光识别Hg²⁺,在1.0～12.0μmol·L^-1范围定量检测Cu²⁺,R=0.998 6,检出限为0.53μmol·L^-1;在3.0～7.0μmol·L^-1范围定量检测Hg²⁺,580 nm处的荧光强度与Hg²⁺浓度呈良好的线性关系,相关系数(R)=0.997 4,检出限为0.56μmol·L^-1。Job’s曲线表明,探针L与Cu²⁺、探针L与Hg²⁺的结合物质的量的比均为1∶1,并对其响应机理进行了探讨。     

重组表达天冬氨酸-β-脱羧酶及其酶学性质

利用p ETDuet-1为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)来源的天冬氨酸-β-脱羧酶(Asd),研究了其酶学性质,考察了p H、p H稳定性、温度、热稳定性、底物浓度对酶活的影响。结果表明,天冬氨酸-β-脱羧酶重组表达成功;最适反应温度和p H分别为45℃和6.0;动力学常数Km和Vmax分别为0.72 mmol/L和10.52 mol/(L·min·g)。0.1 g菌体细胞在10 m L 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液中催化2.0 g L-天冬氨酸,40℃,p H=6.0反应15 h,L-天冬氨酸的摩尔转化率达到98.6%。     

异源表达酮还原酶的重组菌单羰基还原1,2-环己二酮

利用表达糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶的重组大肠杆菌细胞Escherichia coli BL21(p ET-ery KR1)2对1,2-环己二酮进行了催化还原反应,该还原反应为单羰基还原而非双羰基还原,生成的产物为2-羟基环己酮。对重组细胞催化1,2-环己二酮还原的反应条件进行了优化,发现最优的反应条件为底物浓度20 mmol/L,细胞密度80 g/L,p H 6.0,转速120 r/min,温度37℃,且需要添加10 g/L E.coli BL21(p ET-gdh1)辅酶再生系统和0.2 mmol/L NADPH。在该反应条件下,重组菌催化反应10 h后,底物的转化率可高达84.2%。