肺炎链球菌免疫小鼠程序的优化及杂交瘤细胞株的建立

目的优化肺炎链球菌CSR SCS2 clone1小鼠的免疫程序,同时建立肺炎链球菌C多糖(C polysaccharides,CPs)杂交瘤细胞株。方法制备免疫抗原CSR SCS2 clonel,进行小鼠免疫程序优化:抗原量[(0. 5～2)×10~8个、(1～4)×108个、(2. 4～10)×10~8个)]、免疫间隔时间(3 d、1周、2周)、免疫途径(腹腔、腹股沟及尾静脉),同时确定抗原是否添加佐剂,间接ELISA法检测小鼠血清抗体水平。采用优化程序免疫小鼠,取血清效价最高的小鼠脾细胞,经传统单克隆抗体制备技术建立肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞株,并检测细胞株的染色体数目及其分泌抗体的稳定性及特异性。结果确定小鼠最适免疫程序为:抗原量为(1～4)×108个,且需添加弗氏佐剂,免疫间隔时间为1周,免疫途径为腹股沟注射。最适程序免疫小鼠血清抗体效价达1∶12 000以上。建立了3株肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞,命名为A4、G8、H10株,染色体数目分别为98、102和102,分泌的抗体具有良好的稳定性和特异性。结论成功优化了肺炎链球菌小鼠的免疫程序,并建立了肺炎链球菌C-Ps杂交瘤细胞株,为肺炎链球菌荚膜多糖中C-Ps含量检测方法的建立奠定了基础。     

抗狂犬病病毒抗体的制备及酶联免疫法的建立

目的制备具有中和活性的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)抗体,并建立检测RV抗原的ELISA法。方法以RV全病毒免疫2只新西兰家兔,制备抗RV多克隆抗体。以RV全病毒免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,建立稳定分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以小鼠中和试验(MNT)检测抗体的中和活性。以ELISA双抗体夹心法和ELISA竞争法检测RV抗原。结果2只家兔的多克隆抗体ELISA效价分别为1∶6.0×103和1∶1.2×104,纯化的兔抗RVIgG中和活性分别为46.3和29.2IU/ml。获得了9株稳定分泌抗RV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,属于IgG1或IgG2b亚型,腹水的抗体ELISA效价为1∶1.0×105~1∶1.0×107。单克隆抗体3E5、4C2和4F8具有中和活性,Westernblot分析提示,单克隆抗体4C2是针对RV糖蛋白线性表位的抗体。以单克隆抗体4C2作为捕捉抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,建立了ELISA双抗体夹心法,检测RV抗原。同时建立了另一种ELISA竞争法,加入固定工作浓度的单克隆抗体4C2,与RV病毒液孵育,以ELISA间接法检测RV病毒抗原。结论所获得的狂犬病毒多克隆和单克隆抗体具有中和活性,可在ELISA中用于检测RV抗原。     

恶性疟原虫环子孢子蛋白四肽重复序列单克隆抗体的制备

目的制备针对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)NANP四肽重复序列[Asn-Ala-AsnPro(NANP)repeated motif]的单克隆抗体。方法采用马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C偶联法及ADH-EDC介导的BSA与(NANP)5偶联法,将合成的NANP多肽与载体蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠后,采用免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0杂交的细胞融合技术,获得分泌抗(NANP)5多肽单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,间接ELISA法检测效价。通过免疫F1小鼠诱生腹水,采用50%硫酸铵沉淀法盐析纯化后,进行单克隆抗体亚类和特异性鉴定。结果采用2种方法制备了BSA-(NANP)5偶联蛋白,以该蛋白为抗原,获得10株抗(NANP)5多肽阳性杂交瘤细胞株,效价在1∶80 000~1∶640 000之间,均为Ig G1亚类,轻链类型为κ,可被(NANP)5及CSP抗原特异性识别。结论成功制备了抗(NANP)5多肽的单克隆抗体,该抗体可在恶性疟疾疫苗的研发中发挥重要作用。     

玉米赤霉烯酮抗独特型单抗的制备及特异性分析

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)抗独特型单抗Ab2β-1D5。方法将ZEN单抗1G4与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后,以ZEN单抗Fab片段作为包被抗原,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,制备腹水型单抗,并经Protein G亲和层析柱进行纯化。间接ELISA法检测ZEN抗独特型单抗的抗体效价及特异性;间接竞争ELISA法检测ZEN抗独特型单抗类型、灵敏度及其与ZEN毒素间的相关性。结果共获得6株稳定分泌ZEN抗独特型单抗的杂交瘤细胞株,腹水型抗体效价为1∶1.2×105～1∶2.0×105;6株单抗均为β型抗独特型抗体(Ab2β),其中Ab2β-1D5抗体灵敏度最高,对ZEN的IC50值达10.09 ng/ml,其与ZEN毒素呈线性相关(r=0.990);ZEN抗独特型单抗与莱克多巴胺、重金属铅、铬及虾过敏原单抗均无交叉反应,特异性良好。结论已成功制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗,该抗体与ZEN间存在"内影像"关系,可以替代ZEN毒素标准品,用于建立ZEN的无毒免疫学检测技术。     

抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组蛋白p GEX-MIC6作为抗原免疫BALB/c小鼠,收集脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,对融合后的杂交瘤细胞进行筛选后,经腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水,鉴定单抗的亚类。采用辛酸-硫酸铵法结合蛋白亲和层析柱纯化腹水,SDS-PAGE分析抗体的相对分子质量,间接ELISA法检测抗体效价及特异性,BCA蛋白浓度检测试剂盒测定抗体浓度。结果最终获得两株能稳定分泌新孢子虫MIC6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A1和1H11,分泌的抗体分别属于Ig G1和Ig G2b亚类。纯化后的腹水经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约为50 000的重链和25 000的轻链条带,纯化效果较好;1A1和1H11的腹水效价分别为5.12×104和1.024×105,浓度分别为0.935和2.010 mg/ml,两株单抗均能特异性识别新孢子虫,与弓形虫无交叉反应。结论制备的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体特异性较强,为进一步研究新孢子虫MIC6的生物学功能及建立特异敏感的新孢子虫检测方法奠定了基础。     

抗ICAM-1单克隆抗体的制备及其活性

目的制备具有生物活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体。方法以人ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术并经HAT选择培养和克隆化,筛选出稳定分泌抗人ICAM-1 McAb的杂交瘤细胞株,并对McAb进行纯化。用ELISA间接法测定效价并鉴定其亚类,Western blot鉴定其抗原特异性,细胞黏附试验检测其中和活性。结果筛选出1株可稳定分泌抗人ICAM-1抗体的杂交瘤细胞株3F2,杂交瘤染色体众数为98~104。纯化后的单抗蛋白浓度为1.253 mg/ml,纯度达83.6%,效价可达2.56×105。其分泌的抗体亚型为IgG1,腹水效价达5.12×105,可与ICAM-1特异性结合,可抑制ICAM-1与淋巴瘤细胞间的黏附,具有明显的中和ICAM-1的活性。结论已成功制备出抗ICAM-1的McAb,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

流行性出血热病毒单克隆抗体的研究

应用流行性出血热病毒(EHFV)Z_(10)株制备的疫苗免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与BALB/c小白鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,获得10株能分泌ENFV特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其McAbs小鼠腹水荧光抗体滴度达1:2000～1:51200。经免疫印迹试验及ELISA夹心法证明1 0株McAbs为抗EHFV核蛋白(NP)的McAb,均不具有中和抗体活性,有低滴度的血凝抑制活性;经间接免疫荧光试验(IFAT)证明,2株为组特异性的McAb,5株为亚组特异性的McAb,3株为型特异性的McAb。实验用冻存免疫脾细胞进行杂交获得成功,为杂交瘤细胞的研究提供了经验。     

幽门螺杆菌HpaA蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备幽门螺杆菌(H.pylori)HpaA蛋白单克隆抗体,并检测其对H.pylori黏附胃腺癌细胞AGS的抑制作用。方法应用PCR法扩增HpaA基因,构建重组表达质粒pQE30-HpaA,表达并纯化重组HpaA蛋白;以其为抗原免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,采用间接ELISA和Western blot法检测单抗的特异性,间接ELISA检测细胞株培养上清和腹水抗体效价,并对其进行亚型鉴定和杂交瘤细胞株稳定性分析;扫描电镜观察重组HpaA蛋白单抗对H.pylori黏附AGS细胞的抑制作用。结果重组表达质粒pQE30-HpaA经双酶切、PCR及测序证明构建正确;表达的重组HpaA蛋白相对分子质量约为30 000,可溶性蛋白含量约占65%,纯化后纯度达85%以上;经细胞融合及筛选克隆获得了2株能稳定分泌抗HpaA单抗的杂交瘤细胞株,2株单抗与其他肠道细菌均无交叉反应,能与H.pylori全菌体发生特异性反应;乳胶凝集试验证明,该单抗属IgG3、κ型;2株单抗细胞培养液的抗体效价分别为1∶128～1∶256和1∶64～1∶128,腹水抗体效价分别可达1∶6 400～1∶12 800和1∶1 600～1∶3 200;杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体;单抗可抑制H.pylori对AGS细胞的黏附作用。结论已成功制备了H.pylori HpaA蛋白单克隆抗体,为建立新的H.pylori现症感染诊疗方法奠定了基础。     

抗KOD聚合酶单克隆抗体的制备(英文)

单克隆抗体具有高度的均一性和专一性。抗KOD聚合酶单克隆抗体,可以特异性结合于KOD聚合酶,抑制PCR反应前常温状态下的多聚酶活性,显著提高PCR反应的特异性。为了提高KOD聚合酶PCR反应的特异性,以KOD聚合酶为抗原,制备了两株抗KOD聚合酶的单克隆抗体。以大肠杆菌表达的重组蛋白KOD聚合酶为抗原免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过HAT选择培养、ELISA检测和有限稀释法克隆,建立了2株能稳定分泌抗KOD聚合酶单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1F5与3G6,对应的抗体亚型分别是IgG1和IgG2a。染色体计数结果分别是85~90和83~86。1F5与3G6的细胞上清和腹水的ELISA效价分别为1∶28,1∶29和1∶211,1∶211。间接免疫荧光证实制备的单克隆抗体的特异性良好。该结果为进一步建立高特异性的PCR方法奠定了良好的基础。     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。     

绿脓杆菌外膜蛋白对感染的保护作用

目的 寻找一种防治绿脓杆菌感染的有效方法。方法 用绿脓杆菌外膜蛋白免疫的兔抗血清对4种不同血清型的菌株和1株临床绿脓杆菌进行体内外交叉保护性试验。结果 家兔免疫1周后即产生抗体,并逐渐升高,至第6周抗体滴度达到1:163 840,并维持高水平;抗血清能与4种不同血清型菌株和1株临床菌株产生直接凝集反应。第8周的血清(1:8以上)与其外胰蛋白的ELISA抗体效价相近,小鼠的半保护剂量均在0.05～0.11ml之间。结论 外膜蛋白疫苗具有较强的抗原性,而且具有良好的交叉保护作用。     

SV40灭活疫苗免疫恒河猴后的抗体反应

目的评价SV40灭活疫苗免疫恒河猴后的抗体反应。方法用SV40灭活疫苗经肌肉注射免疫0.5~1周岁的恒河猴,分别于第1次和第2次免疫后2周,检测血清中和抗体效价,免疫18个月后检测SV40基因组成分。结果免疫的12只恒河猴在第1次免疫后2周,血清抗体全部阳转,平均抗体滴度为1∶16,第2次免疫2周后血清抗体滴度明显增长,平均达到1∶64~1∶128。用PCR方法未检测到SV40基因组成分。结论SV40灭活疫苗可以有效诱导恒河猴产生特异性抗体反应。     

东方马脑炎病毒E2蛋白的表达、纯化及免疫原性

目的表达、纯化东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus,EEEV)E2蛋白,并检测其对小鼠的免疫原性。方法利用IPTG诱导重组大肠埃希菌BL21-pET30-EEEV-E2,表达E2蛋白,用包涵体纯化试剂盒纯化重组E2蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将BALB/c小鼠随机分为4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组(弗氏佐剂与PBS按体积比1∶1乳化)、E2蛋白组(E2蛋白与PBS按体积比1∶1混合)和E2蛋白+弗氏佐剂组(E2蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1乳化),每组10只,各组均经小鼠后肢肌肉免疫3次,两次免疫间隔时间均为14 d,免疫剂量均为100μl/只。第2次免疫后第7天,采用流式细胞术检测小鼠体内CD4+和CD8+T细胞比例;第2次免疫后第14天,采用细胞因子ELISA定量试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFNγ的含量;第3次免疫后第7天,采用MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;每次免疫后第14天,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体效价。结果表达的重组E2蛋白相对分子质量约为53 000,表达量为菌体总蛋白的26.3%;纯化的重组E2蛋白纯度达95%以上;表达和纯化的重组E2蛋白均可与鼠抗His标签单克隆抗体结合。与PBS对照组、弗氏佐剂对照组和E2蛋白组相比,E2蛋白+弗氏佐剂组小鼠体内CD4+与CD8+T细胞比值、血清中IL-2、IL-4和IFNγ浓度、体内淋巴细胞增殖指数均明显升高(P﹤0.01);小鼠初次免疫后即可产生E2蛋白IgG抗体,且随着免疫时间的延长,抗体效价逐渐上升,第3次免疫后第14天,抗体效价可达1∶320。结论表达并纯化了重组E2蛋白,其能使小鼠产生较强的免疫反应,为新型EEEV疫苗的研制提供了参考。     

无细胞百白破疫苗加强免疫一年后的血清抗体水平

用无细胞百白破疫苗（DTPa）和全细胞百白破疫苗（DTPw）分别进行基础免疫，再用DTPa或DTPw加强免疫，一年后对免疫儿童进行了血清抗体检测。结果各类抗体均较加强免疫后一个月明显下降，3个组中抗—FHA虽有所下降，但均在保护水平以上（＞20EU／ml），抗—PT抗体只有DTPa组大于20EU／ml。3个组中的大多数儿童的百日咳凝集抗体均＜1：320，而抗白喉类毒素（抗—DT）、抗破伤风类毒素（抗—TT）抗体均在保护水平以上。     

高效价麻疹抗血清的制备及检定

目的制备高效价麻疹抗血清,用于疫苗检定中病毒鉴别、支原体检测、麻腮二联和麻腮风三联疫苗的联合滴定试验。方法将麻疹病毒L4株于Vero细胞中传代培养,获得高滴度病毒原液,制备免疫抗原,分别经腹腔注射法、耳静脉注射法和背部皮下多点注射法免疫家兔,制备抗血清,并按规程要求对抗血清进行检定。结果采用腹腔注射法、耳静脉注射法和背部皮下多点注射法免疫家兔所制备的抗血清的中和效价分别为1∶960、1∶2 560和1∶3 840,经检定,3种方法制备的抗血清均达到疫苗检定的使用要求。结论背部皮下多点注射法制备的麻疹抗血清效价最高,且操作简单,可作为制备高效价麻疹抗血清的最佳方案。     

磺胺二甲嘧啶完全抗原的制备及鉴定

目的制备磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine,SM2)完全抗原,并进行鉴定。方法采用重氮化偶联法制备SM2免疫抗原(SM2-BSA)和检测抗原(SM2-OVA),定性和定量分析偶联后的完全抗原,并制备SM2单抗。结果经1%琼脂糖凝胶电泳和10%SDS-PAGE分析表明,完全抗原SM2-BSA和SM2-OVA偶联成功;SM2与载体蛋白BSA和OVA的分子结合比分别为23∶1和17∶1;SM2-BSA和SM2-OVA的蛋白浓度分别为3.24和2.29 mg/ml;完全抗原SM2-BSA能刺激小鼠产生高效、特异的抗SM2抗体;SM2单抗与OVA和BSA无交叉反应。结论已成功制备了完全抗原SM2-BSA和SM2-OVA,为下一步建立灵敏度更高、特异性更强、操作更简便的免疫学检测方法奠定了基础。     

鼬獾狂犬病病毒分离株的培养及其免疫原性

目的对分离的鼬獾狂犬病病毒BHK-21细胞适应株进行毒力和免疫原性检测,为兽用狂犬病疫苗的生产奠定基础。方法将分离获得的鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在BHK-21细胞上连续传代,采用直接免疫荧光法测定病毒滴度(TCID50);PCR法检测外源病毒和支原体。以β-丙内酯灭活病毒液,将灭活的病毒液免疫犬,采用FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体水平,分析其免疫原性。结果鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在体外培养至130代时,病毒滴度可达1.0×107.75 TCID50/ml;未从狂犬病病毒JX08-45株中扩增出犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、腺病毒和支原体的特异性核酸;灭活的病毒液接种犬后产生的中和抗体可持续1年以上,且均在0.5 IU/ml以上。结论鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45经BHK-21细胞传代适应性较好,病毒滴度较高,且具有较好的免疫原性,已具备制备疫苗的基本条件。     

脱二氧喹烯酮多克隆抗体的制备及其直接竞争ELISA检测方法的建立

利用脱二氧喹烯酮（DQCT）的酮基为活性基团,分别采用混合酸酐法和碳二亚胺法合成了其免疫原（DQCT-BSA）和包被原（DQCT-OVA）,用过碘酸钠氧化法将DQCT-OVA与辣根过氧化物酶（HRP）偶联,制备了酶标抗原（DQCT-OVA-HRP）。用DQCT-BSA免疫Balb／C小鼠,获得了效价1：128000的抗DQCT的多克隆抗体。分别用间接竞争ELISA法和直接竞争ELISA法检测DQCT并比较,最终建立了直接竞争ELISA检测方法,其IC50为39．8μg·mL^-1,检测范围为1．6-1258．9μg·mL^-1。为后续实际样品中脱二氧喹烯酮的检测奠定了基础。     

应用ELISA间接法检测VZV IgG

应用ELISA间接法检测人血清的VZV抗体具有高度的特异性。在VZV患者恢复期血清中分别加入VZV、HSV－1、HSV－2和CMV抗原做阻断抑制试验，只有VZV抗原有阻断其IgG抗体的活性，其阻断率达98％以上；血清中存在HSV－1、HSV－2和CMV抗体不影响VZVIgG的检测结果。用本法检测VZVIgG滴度比IFA、CF和NT高数十倍，用于流行病学调查和免疫应答评价均获得满意的结果。     

幽门螺杆菌全菌抗原对母鸡的免疫原性

目的　研究幽门螺杆菌 (Hp)全菌抗原的免疫原性及Anti Hp IgY的预防和治疗作用。方法　用超声Hp波粉碎的Hp抗原免疫产蛋母鸡 ,通过IHA和ELISA间接法检测母鸡的免疫应答。用SDS PAGE分析Hp全菌抗原 ,并用抗Hp IgY做免疫印迹。结果　母鸡免疫成功率为 10 0 %。初免 45d后 ,抗Hp IgYIHA效价为 1∶10 2 4,ELISA效价超过 1∶45 0 0 0。Hp抗原的SDS PAGE显示有 2 6条蛋白染色带 ,其中主带有 10条 ,免疫印迹表明Hp的超声粉碎物特异性抗原蛋白带相对分子质量为 70 0 0 0、6 6 0 0 0、42 0 0 0、3430 0、2 95 0 0、2 70 0、185 0 0。结论　本研究为工业化制备抗Hp IgY奠定了基础