应用16S rDNA克隆文库技术分析陈化烟叶细菌多样性

为较全面地分析陈化烟叶的细菌多样性,利用16S rDNA基因克隆文库技术分析了产自于福建的3个等级处于不同陈化阶段的12个烟叶样品中的细菌组成.采集C/S挑、B22、X21三个等级的陈化烤烟烟叶,陈化时间分别为3、6、12、24个月.实验结果表明,烤烟烟叶在陈化过程中共存在25种细菌,γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)细菌种类最丰富,含有19种细菌,α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)含有3种细菌,芽孢杆菌纲(Bacilli)含有2种细菌,β-变形菌纲(Beta-proteobacteria)含有1种细菌.在12个烟叶样品中,肠杆菌属(Enterobacter)在8个样品中的比例最高,假单胞菌属(Pseudomonas)在2个样品中比例最高,泛菌属(Pantoea)和克洛诺菌属(Cronobacter spp.)分别在样品B6和C3中比例最高.在陈化过程中,烤烟叶面细菌组成没有明显的变化规律.     

16S rDNA克隆文库法分析小龙虾肠道细菌多样性

利用16S rDNA克隆文库法对小龙虾肠道共生细菌进行系统发育分析。采用细菌16S rDNA通用引物以小龙虾全肠DNA为模板扩增共生细菌的16S rDNA并建立基因文库,对得到的基因序列进行系统发育分析。结果表明,从小龙虾肠道共得到24个不同的16S rDNA序列,系统发育分析表明这24个16S rDNA序列代表的克隆分别与柠檬酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌属、巨型球菌属、中慢生根瘤菌属、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒丝菌属菌株的16S rDNA序列最为接近,相似性为83.6%～99.4%。小龙虾肠道内细菌资源丰富,且肠道细菌在小龙虾食物消化过程中发挥一定作用,而16S rDNA克隆文库法在反映小龙虾肠道中主要微生物的物种组成,特别是样本中优势微生物类群上具有一定优势。     

16S rDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中 细菌种群的多样性

目的 利用16S rDNA基因文库分析法, 对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。方法 提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA为模板, 将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA的PCR产物与pMD~18T载体连接, 构建其菌群的16S rDNA文库。对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST比对。结果 文库序列分析表明, 有53个克隆子分属3个不同的类群, 即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群, 其余3个克隆子属于未知类群。其中, 优势细菌类群为厚壁菌类群(86%), 在该类群中, 尤以无乳链球菌为主要代表, 约占所有克隆子的82%; 其他类群为γ~变形菌类群(7.1%)和异常球菌-栖热菌门类群(1.8%)。系统发育分析表明, 未知类群在分类地位上更接近与厚壁菌类群。结论 生鲜牛乳中微生物具有多样性, 无乳链球菌为其中的优势种群, 同时生鲜牛乳中还存在葡萄球菌等致病菌, 或不动杆菌和肠道菌等条件致病菌。     

16S rDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性

目的利用16S rDNA基因文库分析法,对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。方法提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA为模板,将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA的PCR产物与pMD~18T载体连接,构建其菌群的16S rDNA文库。对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST比对。结果文库序列分析表明,有53个克隆子分属3个不同的类群,即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群,其余3个克隆子属于未知类群。其中,优势细菌类群为厚壁菌类群(86%),在该类群中,尤以无乳链球菌为主要代表,约占所有克隆子的82%;其他类群为γ~变形菌类群(7.1%)和异常球菌-栖热菌门类群(1.8%)。系统发育分析表明,未知类群在分类地位上更接近与厚壁菌类群。结论生鲜牛乳中微生物具有多样性,无乳链球菌为其中的优势种群,同时生鲜牛乳中还存在葡萄球菌等致病菌,或不动杆菌和肠道菌等条件致病菌。     

发酵辣椒细菌多样性的16S rDNA测序分析

以家庭自制的剁辣椒、酸辣椒、腌辣椒和辣椒酱为对象,研究不同样品中的微生物多样性,为分离其中的乳酸菌及开发发酵辣椒制品复合发酵剂提供参考依据。采用土壤基因组DNA提取试剂盒提取样品的基因组,然后PCR扩增细菌的16S r DNA V4区,琼脂糖凝胶电泳验证后回收胶,荧光定量后上机进行MiSeq高通量测序,然后分析样品中细菌的多样性。结果显示:不同样品所含细菌的种类多样性和丰度存在较大的差异。在属的水平上,剁辣椒中魏斯氏菌、明串珠菌和乳杆菌是主要的菌属,丰度在16%左右;乳杆菌(61.5%)和片球菌(28.6%)是酸辣椒中主要的细菌;腌辣椒中乳杆菌的丰度达到79.4%;辣椒酱的物种多样性最为丰富,魏斯氏菌(40.7%)和乳杆菌(11%)是其主要的微生物。     

16S rDNA克隆法分析小曲优势细菌

用16S rDNA克隆法对某酒厂小曲中优势细菌进行分析,以期探讨强化酵母菌制曲后酒体风味变差的问题.用SDS-酶裂解法提取小曲总DNA,采用细菌通用引物对用PCR方法扩增其16S rDNA,并对PCR产物进行克隆与测序分析.结果表明,小曲中的优势细菌种类是以植物乳杆菌为主的乳酸菌.故强化制曲后发酵生产的白酒中乳酸乙酯含量增加,乙酸乙酯含量下降,造成酒整体风味变差.     

利用16S rRNA基因克隆文库分析东北自然发酵酸菜中细菌多样性

为了解传统酸菜自然发酵液中细菌多样性和群落的组成结构,采用构建16S rRNA基因文库的方法对酸菜成熟发酵液样品进行了研究。共获得98个克隆子,经过16S rRNA基因全长序列分析,鉴定为7个属,9个种,分别为Lactobacillu scoryniformis、Pediococcus parvulus、Citrobacter murliniae、Clostridium intestinale、Lactobacillu smalefermentans、Lactobacillu splantarum、Leuconostoc citreum、Achromobacter spanius和Enterobacter cloacae。其中,乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcuss)和枸橼酸杆菌属(Citrobacter)为优势菌,分别占64.29%,22.45%和8.16%,其他种类分别占1.02%~2.04%。这些研究结果丰富和完善了酸菜发酵液微生物多样性信息,反映了微生物群落结构特点,为筛选有效的酸菜发酵菌剂提供了技术参考。     

16S rDNA克隆文库法分析两种鱿鱼墨多糖对小鼠肠道菌群多样性的影响

探讨北太平洋鱿鱼墨多糖与秘鲁鱿鱼墨多糖对化疗模型小鼠肠道菌群的影响。将40只Balb/c小鼠随机分为4组:正常组、模型组、北太平洋鱿鱼墨多糖组、秘鲁鱿鱼墨多糖组。采用环磷酰胺化疗模型,无菌收集小鼠粪便并提取细菌基因组DNA,通过构建各组小鼠肠道细菌的16S rDNA克隆文库,单酶切分型,观察鱿鱼墨多糖对肠道菌群的作用。试验结果表明:两种鱿鱼墨多糖对化疗模型小鼠肠道菌群种类有一定调节作用,且两种鱿鱼墨多糖效果不尽相同。     

基于16S rDNA高通量测序技术分析水牛原料乳中细菌的多样性

为研究不同品种水牛原乳中的细菌组成,本研究采用16SrDNA高通量测序技术分析了印摩拉水牛、尼里·拉菲水牛及三品杂水牛原乳中的细菌多样性,结果显示,3品种原料乳样本中的细菌种类覆盖430个种314个属,共540个OTU,其中包括有益菌如乳酸杆菌(Lactobacillus)和致病菌如大肠埃希菌属志贺菌(Escherichia-Shigella);各样本的菌群组成和相对丰度分析结果表明,不同品种原料乳中主要菌群组成和优势菌均呈现明显差异,其中三品杂、摩拉、尼里·拉菲水牛原料乳中的优势菌属分别为肠球菌属(Enterococcus)、籍伏氏菌属(Vogesella)、假单胞菌属(Pseudomonas),样本中还有部分未鉴定的细菌,需要进一步研究。     

保温发酵鱼露中细菌群落的16S rDNA分子生态分析

本文通过对细菌16S rDNA V₄区进行高通量测序,并结合实时荧光定量PCR 法(FQ-PCR)研究35 ℃发酵条件下鱼露的细菌群落多样性。研究发现发酵初期细菌数量快速下降,到后期数量基本保持稳定。鱼露中细菌群落组成复杂,在测序得到的所有细菌OTUs中共注释出37个门、238个属,但有50%左右的OTUs未能注释到属。发酵8个月后,继续增加发酵时间,鱼露中的细菌组成变化不明显。在门的水平上,在鱼露发酵的各个阶段中细菌主要分布在变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);在属分类的水平上,优势菌主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、不动菌属(Acinetobacter)等。发酵前2个月,优势菌是嗜冷杆菌属(Psychrobacter,23.39%)、链球菌属(Streptococcus,5.34%)、乳杆菌属(Lactobacillus,3.05%),发酵12个月时,主要优势菌中变形菌门中以链球菌属(Streptococcus,3.62%)、乳杆菌属(Lactobacillus,3.23%)、葡萄球菌属(Staphylococcus,1.20%)为主,而厚壁菌门以不动菌属(Acinetobacter,9.14%)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter,8.77%)、假单胞菌属(Pseudomonas,6.78%)为主,其中耐盐和嗜盐的乳酸菌主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)等。     

应用16S rDNA全序列测序技术鉴定生鲜乳中的细菌种类

采用玻璃珠法提取生鲜乳中分离的34株细菌基因组DNA,用细菌通用引物(27f/1492r)PCR扩增16S r DNA片段并测序,与Gen Bank数据库同源序列比对,系统发育树聚类分析,并结合形态学和生理学特征确定了34株菌的种属地位。结果表明,共鉴定出16个种属。3个生鲜乳样中细菌种类及其分布特点不同。其中1号样有7种细菌,以Acinetobacter sp.(不动杆菌属)为主,2号样有6种细菌,以Klebsiella sp.(克雷贝氏杆菌属)为主,3号样有6种细菌,分布较为分散。从致病性来看,分离菌株主要为条件致病菌或腐败菌,无烈性致病菌。      

应用16SrDNA克隆文库法分析雪菜低盐腌制过程微生物群落的多样性

雪菜低盐腌制保藏对资源节约,减少含盐废水排放及蔬菜营养保持等具有重要意义。应用构建的16S rDNA克隆文库方法,研究低盐腌制雪菜在不同发酵时期的细菌多样性及主要指标的变化情况。结果表明,整个腌制体系微生物种类丰富,主要分为2大类:肠杆菌目(Enterobacteriales)和乳杆菌目(Lactobacillales)。随着腌制发酵时间的不同,5个不同时期环境中细菌群落组成存在较大的差异。腌制初期阶段,主要优势菌群为肠杆菌目中的肠杆菌属和欧文菌属;发酵中、后期主要优势菌群发生改变,主要为乳杆菌目中的乳杆菌属,其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)起主导作用。此外,雪菜腌制过程中乳酸菌数量及pH也相应地发生变化。     

基于16S rDNA高通量测序分析水牛初乳与常乳中细菌多样性

目的:利用16S rDNA高通量测序研究广西水牛研究所种畜厂三品杂水牛初乳与常乳的细菌多样性.方法:提取当天采集的生水牛乳样本的细菌总DNA,PCR扩增其16S rDNA,利用纯化后的扩增片段构建其菌群的16S rDNA文库,采用Miseq PE300平台进行高通量测序以及BLAST比对.结果:初乳组样本共得到19个门...     

16S rDNA技术在乳粉阪崎肠杆菌监测中的应用

通过对婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的检测,利用16S r DNA基因测序方法验证沙门显色培养基上分离到的蓝绿色的菌落进行监控的必要性。在进行监测的环境和原料样品中,通过对依据GB4789.4-2010监测沙门氏菌时从沙门氏菌显色培养基上分离出的,经API20E鉴定为阳性的阪崎肠杆菌的蓝绿色菌落进行基因测序。利用Micro SEQ ID微生物鉴定系统(ABI)进行16S r DNA基因测序分析,构建系统发育树,鉴定种属。结果表明:7株从沙门显色培养基上分离到的环境中的阪崎肠杆菌,经16S r DNA基因测序验证其中5株为阪崎肠杆菌,其余两株均为梨形肠杆菌。2株从沙门显色培养基上分离到的原料中的阪崎肠杆菌,经16S r DNA基因测序验证一株为梨形肠杆菌,另一株为溶解肠杆菌。实验过程中的9株菌,被证实为阪崎肠杆菌阳性的为5株,比例高达55.6%。由此可见,对沙门显色培养基上蓝绿色菌落进行监控十分必要,这一结论也为乳品企业中阪崎肠杆菌的防治、排查及溯源提供依据。     

应用16S rDNA分析撒坝火腿表面和内部微生物多样性

为分析云南撒坝火腿中微生物的菌群构成、物种丰富度和多样性差异,以1年以上的撒坝火腿为研究对象,通过提取DNA,采用Illumina高通量测序方法对火腿表面和内部细菌的16S rDNA V3～V4区和真菌ITS2区进行扩增和测序,并对其菌落构成和多样性进行分析。结果表明:撒坝火腿中微生物菌群存在差异,细菌丰富度极显著高于真菌(P<0.01),多样性高于真菌,且内部真菌和细菌微生物多样性和丰富度均高于表面;子囊菌门下曲霉菌属是表面和内部真菌中的优势菌群,其次Yamadazyma和青霉菌属也是主要菌群,这些菌属在火腿表面的分布多于内部;厚壁菌门下葡萄球菌属是火腿表面和内部细菌中的优势菌群,色盐杆菌、酸杆菌和链球菌也是表面的主要菌群;放线菌、杆菌属、酸微菌纲及球菌属则是火腿内部的主要菌群,此外火腿内部还存在大量未知微生物。综上所述,曲霉菌和葡萄球菌是撒坝火腿表面和内部的优势菌群。     

利用16S rDNA序列分析宜宾芽菜中细菌菌群

使用ClustalX 2.0和MEGA 4.1软件对从宜宾芽菜中分离出的9株细菌(AY,AZ,AH,AI,AJ,AK,AL,AG,AO)的16SrDNA序列进行比对、分析,并绘制系统发育树。经鉴定,该9个菌株可分为3个种群,其中AY,AZ,AH,AL,AK,AJ这6个菌为第一种群;AO,AI为第二种群;AG为第三种群。结果表明:利用16SrDNA序列的分子生物学方法可以实现细菌菌群的快速分类鉴定,与传统方法相比具有简便、快速等优点。     

传统东北酸菜发酵过程中的细菌动态及多样性

为筛选控制酸菜发酵的微生物接种剂,本研究跟踪传统东北酸菜发酵过程,解析其细菌动态和多样性。结果显示,p H在发酵的第8d已下降到4.1,之后稳定在4.0左右;可溶性糖变化主要出现在发酵的前18d,由最初的11.4%干物质(DM)下降到3.9%DM;在发酵的第6d,亚硝酸盐含量最高(31.3mg/kg湿样),到发酵的第30d,下降到4.8mg/kg湿样;发酵结束时体系中的乳酸和乙酸含量分别为6.7g/L和0.6g/L;在体系中检测到了一般细菌Acinetobacter sp.,Pseudomonas fragi,Klebsiella sp.,Citrobacter sp.,Betaproteobacteria sp.和乳酸菌Leuconostoc mesenteroides,Lactobacillus curvatus,Lact.plantarum及Lact.oligofermentans。在发酵第6d,乳酸菌总量占总体的63.8%,异型发酵乳酸菌Leuc.mesenteroides占32.9%;随后乳酸菌比例一直增加,直到发酵的30d,所检测到的细菌全部为乳酸菌;Lact.curvatus在发酵的第6d,达到总体的21.1%,到发酵的第12d,已经达到41.1%,以后一直维持在45%以上;首次检测到Lact.oligofermentans,其在发酵的12d达到增殖高峰,占总比例的21.1%。综上可见,传统东北酸菜发酵过程是以乳酸菌为主导的发酵过程,其发酵过程中的优势乳酸菌为Lact.curvatus,该结果为筛选有效的酸菜发酵菌剂提供了技术参考。      

熟制鲍鱼残留细菌的分离及16S rDNA鉴定

为控制熟制鲍鱼残留的细菌污染,采用平板划线分离技术对烘制加工后鲍鱼中残留的主要菌群进行分离,并通过菌落形态观察、革兰氏染色分析和16S rDNA 序列比对等方法对其进行鉴定. 结果表明,残留在烘制加工后鲍鱼的主要菌群有希瓦氏菌属、不动杆菌属、库特氏杆菌属、海洋类香菌、蜡样芽孢杆菌、肠杆菌属、彭氏变形杆菌等.     

传统东北酸菜发酵过程中的细菌动态及多样性

为筛选控制酸菜发酵的微生物接种剂,本研究跟踪传统东北酸菜发酵过程,解析其细菌动态和多样性。结果显示,p H在发酵的第8d已下降到4.1,之后稳定在4.0左右;可溶性糖变化主要出现在发酵的前18d,由最初的11.4%干物质(DM)下降到3.9%DM;在发酵的第6d,亚硝酸盐含量最高(31.3mg/kg湿样),到发酵的第30d,下降到4.8mg/kg湿样;发酵结束时体系中的乳酸和乙酸含量分别为6.7g/L和0.6g/L;在体系中检测到了一般细菌Acinetobacter sp.,Pseudomonas fragi,Klebsiella sp.,Citrobacter sp.,Betaproteobacteria sp.和乳酸菌Leuconostoc mesenteroides,Lactobacillus curvatus,Lact.plantarum及Lact.oligofermentans。在发酵第6d,乳酸菌总量占总体的63.8%,异型发酵乳酸菌Leuc.mesenteroides占32.9%;随后乳酸菌比例一直增加,直到发酵的30d,所检测到的细菌全部为乳酸菌;Lact.curvatus在发酵的第6d,达到总体的21.1%,到发酵的第12d,已经达到41.1%,以后一直维持在45%以上;首次检测到Lact.oligofermentans,其在发酵的12d达到增殖高峰,占总比例的21.1%。综上可见,传统东北酸菜发酵过程是以乳酸菌为主导的发酵过程,其发酵过程中的优势乳酸菌为Lact.curvatus,该结果为筛选有效的酸菜发酵菌剂提供了技术参考。     

红腌菜发酵过程中细菌多样性动态分析

为探究红腌菜自然发酵过程中细菌的组成及演替规律,以工厂发酵和农户发酵红腌菜为研究对象,利用Illumina Miseq高通量测序技术对红腌菜发酵过程中的细菌多样性进行解析,并结合PICRUSt软件预测细菌功能的变化。结果表明,工厂发酵和农户发酵红腌菜共获得有效序列分别为332195和1391172条,聚类后分别得到494和388个OUT;整个发酵过程以变形菌门和厚壁菌门为优势菌门,两者相对丰度之和大于70%;乳酸杆菌目为发酵中后期的优势菌目,工厂发酵和农户发酵样品的相对丰度分别为76.74%～98.05%和53.13%～60.32%;属水平上,工厂发酵样品发酵后期以乳酸杆菌属绝对优势菌属;农户发酵样品以乳球菌属、不动杆菌属、乳酸杆菌属、明串珠菌属为优势菌属。工厂发酵和农户发酵红腌菜样品中细菌群落的主要功能均包含碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢、其他氨基酸代谢四条KEGG 途径。本研究增强了对红腌菜发酵过程中细菌群落动态演替情况的了解,可为传统红腌菜生产工艺的改进及优良菌种的筛选提供参考。