高产靛蓝色素大肠杆菌基因工程菌的构建及其发酵条件优化

通过基因重组技术构建重组苯乙烯单加氧酶基因的高产靛蓝色素大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli AB,研究优化工程菌E. coli AB生物合成靛蓝色素的发酵条件。单因素试验分别考察不同发酵温度、底物质量浓度、起始pH值和接种量4 个因素对于靛蓝色素合成的影响,选取发酵温度、底物浓度和起始pH值3 个对靛蓝色素产量影响显著的因素进行响应面设计试验优化。经模型分析获得优化发酵条件为：底物质量浓度0.95 mg/mL,发酵温度29 ℃,起始pH 6.9。在该条件下,工程菌E. coli AB催化合成靛蓝色素产量为67.65 mg/mL。优化发酵条件的实验结果与预测值相符,说明回归模型切实可行。     

高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌的构建及靛蓝色素稳定性

目前国内外天然食用蓝色素资源稀缺,利用微生物发酵制备的靛蓝色素是天然蓝色素的重要来源之一。本文克隆了假单胞菌B3的苯乙烯单加氧酶基因sty AB,将其在大肠杆菌中进行了异源超量表达,构建了高产靛蓝色素的基因工程菌株E-AB,并研究了温度和光照等环境因素对靛蓝色素稳定性的影响。结果表明,工程菌以吲哚为底物合成靛蓝色素最高产量为68.9 mg/L,较野生型菌株提高约5.4倍。温度和光照条件对靛蓝色素色度稳定性具有显著性影响,低温和避光条件能显著延缓靛蓝色素的降解,而高温和紫外光则加速其降解;靛蓝色素降解反应较复杂,靛红是主要的降解产物之一。研究结果将为天然靛蓝色素的高效生物转化制备及应用提供了理论支持和技术指导。     

产丙谷二肽重组大肠杆菌的构建及发酵优化

SAET基因编码的α-氨基酸酯酰基转移酶能够以丙氨酸甲酯盐酸盐和谷氨酰胺为底物缩合生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺.为了使α-氨基酸酯酰基转移酶能够在大肠杆菌中过量表达,在保证氨基酸序列不变的前提下,优化密码子和m RNA二级结构,共改变了396个碱基,GC含量由原来的42.15%升高到48.22%;将优化后的基因分别与phoC启动子和色氨酸串联启动子相连并插入到不同质粒中,将重组质粒转入大肠杆菌,DH5α/p ET21a-phoC-SAET产量最高。通过对重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的条件研究发现,最佳培养基是:葡萄糖15 g/L,酵母提取物10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NH_4AC 5 g/L,KH_2PO_46.75 g/L,K_2HPO_42.25 g/L,MgSO_4·7H_2O0.5 g/L。最适转化条件是:将发酵液加入到含Ala-OMe·HCl 100 mmol/L,Gln 50 mmol/L的pH 9的溶液中,25℃反应1.5 h。优化后产量达到383 mg/L,是优化前的3.9倍。     

乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.Lactis产丁二酮发酵条件研究

对乳酸乳球菌乳亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis发酵丁二酮条件进行研究,通过正交试验优化确定其最佳产丁二酮发酵条件为:温度37℃,起始pH6.5,接种量5%,柠檬酸钠的添加浓度0.75%。在此条件下,菌株在脱脂乳培养基中丁二酮的产量可达到69.58 mg/L。     

烟曲霉素5 L罐发酵条件优化及中试

以烟曲霉（Aspergillus fumigatus）CEA-1701为生产菌株,通过高效液相色谱（HPLC）法测定发酵液中烟曲霉素的含量,考察碳源、pH值、搅拌速度、发酵温度和接种量对5 L发酵罐中烟曲霉素产量的影响,优化了5 L罐的发酵工艺条件。结果表明,甘油作为唯一的碳源,发酵温度30 ℃,搅拌速度800 r/min,接种量为3%,自然pH条件下,通气量0.5 m3/h,烟曲霉CEA-1701产烟曲霉素效果理想,发酵168 h烟曲霉素产量达到97.76 mg/L。将优化后的工艺进行20 L罐的放大试验,0.5%接种量发酵252 h时烟曲霉素获得最高产量达到130.57 mg/L,中试放大效果良好。     

植物乳杆菌发酵生产苯乳酸的条件优化研究

苯乳酸(Phenyllactic Acid,PLA)能够抑制多种腐败菌与致病菌,具有抑菌谱宽、稳定性高、溶解性好等优点,是一种新型天然抑菌物质。以苯丙氨酸为底物,利用传统微生物发酵方法生产苯乳酸,并通过单因素试验、正交试验优化了发酵温度、pH、接种量和底物。结果表明,植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AB-1发酵苯乳酸的产量随着发酵时间增加而增加,在24 h达到最大值,然后趋于稳定。植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AB-1发酵生产苯乳酸的最佳条件为:发酵时间48 h、发酵温度37℃、初始pH6.4、初始接种量2%、苯丙氨酸添加量3.470 g/L,优化后苯乳酸的产量为(252.44±2.63)mg/L,与优化前(115.99±4.25)mg/L相比,产量提高了1.17倍。     

发酵生产紫色杆菌素的培养基及发酵条件优化

目的:考察一株分离自北京小汤山山羊乳中能够生产紫色杆菌素的嗜冷菌,对其发酵条件进行优化,提高紫色杆菌素的产量。方法:采用均匀设计的方法对碳源、氮源、生长因子、初始p H值、接种量及装液量进行优化,根据试验结果,分别对发酵培养基和发酵条件进行正交试验,采用分光光度法检测紫色杆菌素的产量。结果:该嗜冷菌生产紫色杆菌素的最佳发酵条件为:麦芽糖1.8 g/L,胰蛋白胨+牛肉浸膏7 g/L,色氨酸1.3 g/L,初始p H值7.5,接种量5%,装液量30 mL/250 mL。在最优条件下,紫色杆菌素产量达到2.87 g/L,较原产量2.13 g/L增长了34.7%。结论:采用均匀设计和正交试验联用的方法可以简化试验步骤,克服单独使用的局限性,具有更大的发展价值。     

冬虫夏草菌产虫草素发酵条件的优化

以从青海玉树地区野生冬虫夏草中分离的冬虫夏草菌为材料,采用正交试验设计法对2株不同的冬虫夏草菌CS-2和CS-5液体发酵产虫草素的条件进行了优化。结果表明,CS-2的最优发酵条件为:培养基初始pH 6.5、接种量6%、发酵温度22℃、发酵时间7 d。在此条件下,虫草素产量达到0.98 mg/mL。CS-5产虫草素的最佳发酵条件为:接种量9%、发酵温度20℃、发酵时间6 d、培养基础pH 6.5。在此发酵条件下,虫草素的产量为0.482 mg/mL。     

维生素对大肠杆菌Escherichia coli.JN8产L-色氨酸的影响

研究了9种维生素对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长及其发酵产L-色氨酸产量的影响,并对发酵培养基中的维生素浓度进行了优化。结果表明,低浓度肌醇和叶酸可显著促进大肠杆菌的生长及L-色氨酸的合成,叶酸和肌醇的最适添加量分别为0.000 2 mg/L和0.2 mg/L;较高浓度的生物素可以明显促进菌体生长及色氨酸的合成,其最适添加量为0.12 mg/L;较低浓度VB6的添加严重抑制色氨酸的合成,当其质量浓度增至0.8 mg/L时,菌体浓度和色氨酸的产量均较对照有显著的提高,分别提高11.8%和27.2%。添加VB5可略微提高色氨酸的产量,最优质量浓度为0.4 mg/L。添加VB1、VB2、VB3和VC虽然对菌体的生长均有较强的促进作用,但对于色氨酸合成却有不同程度的抑制作用。     

采用补料生物反应器对产L-色氨酸发酵条件的优化

L-色氨酸在医药、食品和饲料等方面广泛应用,市场需求量不断增加。本文以L-色氨酸生产菌大肠杆菌TRTH在小型生物反应器上进行了发酵条件的摸索和优化,通过对接种量、发酵过程pH、供氧等发酵条件进行了优化,获得优化的L-色氨酸发酵工艺条件,在最优条件下产酸量可达12.3g/L。     

大肠杆菌高密度培养发酵L-色氨酸

为实现高水平的大肠杆菌高密度培养,提升发酵法产L-色氨酸的生产效率,以大肠杆菌TRTH为供试菌株,在初始发酵工艺的基础上,先后对发酵接种量和底物KH_2PO_4添加量各设置4个梯度进行发酵对比试验,并着重考察了底物KH_2PO_4添加量对菌体生长、产酸、磷酸盐消耗、糖酸转化率及副产物积累的影响。试验结果表明,在接种量为20%(体积分数),底物KH_2PO_4添加量为10 g/L时,最高菌体密度达到65. 39 g/L,最终L-色氨酸产量为59. 55 g/L,分别较优化前提高了45. 99%和31. 17%,发酵延滞期明显缩短,菌体生长迅速,原料利用率大幅提高,主要副产物积累量较低,发酵总体水平达到最优。为大肠杆菌高密度培养在L-色氨酸发酵中的应用提供了一个成本低、可行性高的新策略,同时为L-色氨酸发酵生产中底物磷酸盐的调控提供了参考。     

红曲霉菌产Monacolin K固体发酵条件的优化

对Monacusspp.3的固体发酵生产MonacolinK的培养条件和培养基进行了优化.考察了物料厚度、起始含水量、发酵时间、起始pH值等发酵条件,以及大米培养基中添加附加碳源、氮源、磷酸盐等的影响.结果表明,固体发酵的培养条件为:物料(大米)厚度在4cm以下,起始pH值自然,培养温度32℃,相对湿度60%～70%,发酵时间为12d;经单因素和正交试验得适宜的发酵培养基为:大米100g,甘油0.2g,玉米浆0.15g,起始含水量50%.且以此优化条件固体发酵培养,MonacolinK产量稳定在1.4mg/g左右,最高产量为1.6mg/g.     

乳酸菌SK 005发酵产GABA(γ-氨基丁酸)的条件优化

GABA(γ-氨基丁酸)是一种天然存在的功能性氨基酸,具有降低血压、改善脑功能、镇静、增强长期记忆及提高肝、肾机能等生理活性.通过对乳酸菌SK 005发酵产GABA的条件设计了一系列优化实验,得到了最佳的发酵条件.以一次回归正交设计实验,运用方差分析确定了最佳的发酵温度,发酵时间,培养基起始pH.安排五水平正交实验研究豆粕粉,玉米浆粉,酵母味素,葡萄糖,K2PHO4,MSG对发酵产GABA的影响,逐步回归法找出主要影响因子豆粕粉,玉米浆粉,MSG.利用中心组合设计与响应面分析进一步考察这三个主要影响因子,确定了最佳培养基的组成及浓度.乳酸菌SK 005发酵产GABA的优化发酵条件为发酵温度30℃,发酵时间2 d,培养基起始pH 6.8,培养基成分葡萄糖5g/L,豆粕粉21.5 g/L,玉米浆粉21.8g/L,MSG 9.5g/L,实验结果有良好的重现性,GABA产量达5.4g/L.     

磷酸盐和pH值协同调控大肠杆菌发酵合成5-羟基色氨酸

为了提高大肠杆菌合成5-羟基色氨酸能力，该研究设计构建了pSTV28-TPH150过表达质粒，增强了羟化酶基因TPH150的表达，以HTP10为出发菌株(代谢工程实验室保藏，专利号：CN202110714155.1),电转化pSTV28-TPH150质粒得到菌株HTP10-1,发酵结果显示，存在副产物L-色氨酸积累过多，质粒不稳定等问题，因此在初始发酵工艺的基础上，通过设计4个pH梯度进行发酵对比试验和4种不同磷酸二氢钾流加策略来探究最适发酵工艺。实验结果表明，在菌株HTP10-1发酵pH值为6.7,并于发酵培养基中添加1 g/L磷酸二氢钾，葡萄糖补料瓶中添加3 g/L磷酸二氢钾时，菌体比生长速率达到最优，发酵结束后5-羟基色氨酸积累量最高达到5.46 g/L,副产物L-色氨酸积累量减少到1.37 g/L,质粒丢失率较对照组减少32%,极大地提高了菌株HTP10-1的质粒稳定性，验证了磷酸盐与发酵pH调控菌体生长的可行性，对质粒工程菌的发酵控制具有重要参考意义。     

烟曲霉素发酵条件的初步优化及其扩大培养

为了获得适宜的烟曲霉素发酵条件,提高烟曲霉素产量。以烟曲霉CEA-1701为生产菌株,运用HPLC测定烟曲霉素含量。通过单因素试验确定各因素范围,进一步运用Plackett-Burman(PB)和Central-Composite Design(CCD)设计优化适合烟曲霉CEA-1701产烟曲霉素的发酵条件,最后对优化的结果进行5L罐的扩大培养。PB试验表明,温度和p H是影响烟曲霉素产量的主要因素;CCD优化得到的产烟曲霉素的发酵条件为:温度32℃、培养基初始p H 6.24、装液量50/250m L、接种量1%(v/v)、玻璃珠添加量5颗。以优化后的条件进行摇瓶和5L发酵罐发酵,烟曲霉素的产量分别提高了18.7%和34.6%,达到73.58mg/L和83.42mg/L。试验优化了烟曲霉CEA-1701产烟曲霉素的发酵条件,初步得到了5L发酵罐的发酵参数,扩大培养显著提高了烟曲霉素的产量。为烟曲霉素的进一步发酵生产提供了依据。     

粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。酪氨酸经其催化生成对香豆酸,可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。作者选取来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶,对其基因进行大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性优化,合成基因后于E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、分子筛纯化后得到了纯化的酪氨酸解氨酶,比酶活达到1.78 U/mg。在相同的培养条件下,以不同的质粒作为表达载体,获得了不同的对香豆酸产量。其中以酪氨酸为底物发酵24 h,当以p ET-32a(+)作为表达载体时,获得最高的对香豆酸产量196.3 mg/L。经密码子优化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地应用于苯丙素类物质的合成途径构建,不同载体的应用也为生物法生产对香豆酸提供了更多的选择依据。     

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D（rebaudioside D,RD）合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21（DE3）构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A（RA）获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930?mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21（DE3）工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1?051?mg/L。     

响应面法优化大肠杆菌生产顺,顺-粘康酸

运用响应面法对大肠杆菌ATCC69875生产顺,顺-粘康酸(CCMA)的发酵条件进行了优化研究。首先利用单因素实验,研究大肠杆菌在不同起始菌体浓度、底物葡萄糖浓度以及诱导剂IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)浓度下对CCMA生产的影响。在此基础上,综合考虑3个因素对大肠杆菌ATCC69875产CCMA的影响,采用Box-Behnken设计以及响应面分析法,确定其优化后发酵条件为:菌体浓度为17.85 OD,葡萄糖为15.93 g/L,IPTG为0.15 mmol。优化后CCMA产量为3.94 g/L,比优化前产量提高了3倍。     

富硒大豆的灵芝菌丝体液态发酵条件优化

以富硒大豆为原料,采用液体发酵技术对富硒大豆的灵芝菌丝体液态发酵条件进行研究。富硒大豆经浸泡、磨浆、过滤、煮沸后接种灵芝菌种发酵,以水解度为指标,通过单因素和正交试验对温度、初始pH值、摇瓶转速及豆浆质量分数等发酵条件进行优化。结果表明：富硒大豆的灵芝菌丝体液态发酵最佳条件为发酵温度28℃、培养基初始pH5.8、摇瓶转速160r/min、豆浆质量分数5%、发酵时间132h。在最佳发酵条件下,大豆蛋白的水解度达27.8%、大豆多肽产量7.0178mg/L、多糖产量1.75mg/L、灵芝酸产量0.66mg/L。     

大肠杆菌发酵产L-色氨酸培养基及补料优化

为了进一步提高优化大肠杆菌发酵产L-色氨酸的产量,采用响应面法优化了原初始发酵培养基组合成分,建立了乙酸铵-玉米浆补料模式。结果表明优化后培养基组合:0.12%硫酸铵、0.7%磷酸二氢钾、0.15%一水柠檬酸、0.28%七水硫酸镁、0.05%酵母粉、0810 0.39%乙酸铵、0.3%玉米浆。5 L罐的培养验证表明,玉米浆和乙酸铵是影响L-色氨酸产量的主要成分因素,优化后L-色氨酸产量提高了35.4%,发酵结束达到24.53 g/L,单位菌体L-色氨酸产量提高了19.8%,达到0.272 g/OD,糖酸转化率提高了27%,为L-色氨酸发酵提供一定的参考。