速冻面米制品中金黄色葡萄球菌和肠毒素A基因三重PMA-qPCR快检方法的建立

为建立准确定量速冻面米制品中金黄色葡萄球菌活菌,筛查肠毒素sea基因并指示PCR反应假阴性的三重PMA-qPCR检测方法。针对金黄色葡萄球菌特异靶基因RpiR和肠毒素基因sea序列保守区,设计引物、探针和构建扩增内标,优化建立三重qPCR检测体系,建立PMA食品前处理方法去除死菌DNA,构建纯培养物和速冻面米制品中污染金黄色葡萄球菌的定量标准曲线,应用三重PMA-qPCR方法检测人工污染金黄色葡萄球菌的速冻面米制品。采用GB4789.10-2016中规定的选择平板计数法,评价三重PMA-qPCR方法的检测性能。结果表明,三重PMA-qPCR检测体系扩增效率高,特异性好。当食品中金黄色葡萄球菌污染量大于10~3CFU/g时,靶基因RpiR可获得有效扩增,污染量在10~3～10~7CFU/g之间时,扩增曲线线性良好(R~2=0.994),PMA-qPCR定量结果与平板计数结果一致性较好。当sea阳性菌株污染量大于10~3CFU/g时,应用PMA-qPCR方法可有效评估食品污染肠毒素A的风险。综上所述,本研究建立的三重PMA-qPCR检测方法操作简便,可快速定量检测速冻面米制品中金黄色葡萄球菌,评估食品污染肠毒素A的风险。     

DNA 提取方法对实时荧光定量 PCR 检测花生过敏原 Ara h 2 基因的比较研究

目前,食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠（Sodium Lauroyl Sarcosine）磁珠法（简称SLS磁珠法）的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生含量为0.05%～1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用一条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。     

速冻食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与应用

为实现速冻食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多重聚合酶链式反应(PCR)检测,首先优化多重PCR扩增的反应条件,比较基因组DNA提取方法,结果表明：退火温度采用60℃、各引物浓度200nmol/L及扩增循环35次,本多重PCR检测技术可以有效地将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检出,检测特异性为100%。3种DNA提取方法中试剂盒法纯度最高,检出限分别是31、26DNA copies/reaction。经过在人工污染致病菌的速冻水饺中应用试验后,该多重PCR方法经过4h的增菌培养即可从速冻水饺中同时检测出起始菌落数低至100CFU/g的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

基于裸磁珠的金黄色葡萄球菌富集优化

本文研究了裸磁珠对金黄色葡萄球菌吸附效果,优化吸附条件,研究金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的吸附情况,最终将其应用于牛肉样品中金黄色葡萄球菌的检测。通过实验,优化裸磁珠吸附菌体的最小磁珠用量,最小吸附体积和最短吸附时间,并分析是否满足荧光PCR检测需要。结果表明:裸磁珠对浓度为102～107 cfu/mL金黄色葡萄球菌的吸附率在95%以上,有较好吸附效果;10 mg裸磁珠在5 mL菌液中吸附10 min,从磁珠上提取的DNA浓度和纯度可以满足荧光PCR的检测要求;裸磁珠在混合菌体中吸附到的金黄色葡萄球菌可以被荧光PCR检测出来,裸磁珠在牛肉样品中吸附浓度为102 cfu/mL金黄色葡萄球菌提取的DNA可以被荧光PCR检测出来。因此,裸磁珠可用于食品中金黄色葡萄球菌的富集,满足荧光PCR检测菌体量要求。     

食品中致病微生物检测结果的不确定度评定

了解本地区抽查的速冻面米制品的微生物指标状况,并探讨金黄色葡萄球菌的定量检测的数值结果的不确定度评定方法。按照国标法GB 4789.1-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》、GB 4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》、GB 4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》和GB 19295-2011《食品安全国家标准速冻面米制品》进行抽样和检测,依据JJF1059.1-2012《测定不确定度评定与表示》,泊松分布及相关统计学方法对检测结果数字不确定度进行评定。抽检的142批次速冻面米制品,两种制品抽检合格率都为100%,得出的两份样品检测结果平均数分别为290 CFU/g和20 CFU/g,相对应该的标准不确定度分别为30 CFU/g和4 CFU/g。本文采用的评定方法,可以对面米制品金黄菌定量检测结果平均数不确定度作出估计,用于速冻面米制品的安全评估。     

粮食真菌DNA快速高通量提取方法的建立与应用

目的 建立一种高效、快速、高通量的粮食中真菌DNA提取和分析方法,并应用于小麦产脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)镰刀菌污染状况研究。方法 基于磁珠纯化技术,开发了一种粮食基质中真菌DNA的快速提取方法—月桂酰肌氨酸钠(sodium lauroyl sarcosine, SLS)磁珠法,结合前期采用实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR, qPCR)和微滴式数字PCR法(droplet digital PCR, ddPCR)建立的小麦中3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol, 3-ADON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol, 15-ADON)两种产DON毒素化学型镰刀菌及禾谷镰刀菌复合群分析方法,对其提取效果进行了验证并分析了我国2021年新收获小麦产DON镰刀菌的污染水平。结果 与十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、柱式法试剂盒和磁珠法试剂盒相比较,本研究建立的SLS磁珠法裂解过程无需水浴,配合自动化提取设备工作,整个提取时间小于1 h,对禾谷镰刀菌复合群的提取率最优,而对3-ADON和15-ADON化学型镰刀菌的提取率与经典CTAB法、磁珠法试剂盒没有显著性差异,并且显著性优于柱式法试剂盒。在对2021年收获的120个小麦样品监测结果显示,产DON镰刀菌的生物量与DON毒素水平之间具有极显著的相关性(P<0.01)。结论 SLS磁珠法适用于从基质复杂的粮食样品中提取真菌DNA,操作简便快速、提取率高,更易实现大样本量的分子生物学准确定量检测需求。     

不同核酸提取方法用于多重荧光PCR法检测3种混合熟肉的比较分析

目的 探讨不同核酸提取方法以及蒸、煮、烤烹饪方式制作的混合熟肉制品的多重荧光定量PCR检测结果之间的差异。方法 用3种不同的提取方法：抽提法、离心柱法及磁珠法,提取经过蒸、煮、烤烹饪方式制作的牛、鸡、猪、鸭混合样品的DNA,通过对不同方法提取DNA的质量及提取DNA用于多重荧光PCR检测的效果方面进行比较。结果 三种方法提取DNA的浓度及纯度无明显差别,磁珠法提取的混合样品DNA进行多重实时荧光PCR检测的Ct值最小,扩增效果最佳。结论 该研究中磁珠法提取熟肉制品DNA的检测效果更为理想。     

一种快速高效的DNA提取方法及其在qPCR检测金黄色葡萄球菌中的应用

探究一种高效快速便捷地提取菌体DNA的方法,并将其应用于金黄色葡萄球菌的定量检测。运用热裂解过柱法和直接热裂解法提取菌体DNA,同时用试剂盒法提取DNA作为对比。用qPCR检测技术对样本DNA的提取效果进行验证,并将最优的提取方法应用于纯培养的和人工污染的鱼样品中金黄色葡萄球菌的检测。qPCR检测结果显示热裂解过柱法仅比试剂盒法低一个梯度,体现了热裂解过柱法良好的稳定性、高效性和实用性。热裂解过柱法可高效提取样品中金黄色葡萄球菌的DNA,结合qPCR技术,其检测灵敏度可达1.04×10~2 cfu/m L。     

《速冻面米制品》国家标准出台

近日,卫生部发布了食品安全国家标准GB19295—2011《速冻面米制品》,于2011年12月21日开始实施。该标准适用于预包装速冻面米制品。对于生制品的微生物限量指标,标准规定了金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。对于熟制品的微生物限量指标,除了金黄色葡萄球菌和沙门氏菌外,标准还规定了菌落总数和大肠菌群指标。     

2012年河南省市售生制速冻面米制品食源性致病菌污染状况监测

了解2012年河南省境内市售生制速冻面米制品中金黄色葡萄球菌和沙门菌的污染状况。方法 金黄色葡萄球菌、沙门菌检测及血清分型参照2012年《国家食品安全风险监测工作手册》,金黄色葡萄球菌肠毒素的测定参照mini-VIDAS试剂使用说明。结果 344份速冻面米制品中检出金黄色葡萄球菌和沙门菌共计55株,总检出率为15.99%,其中金黄色葡萄球菌49株(14.24%),沙门菌6株(1.74%)。金黄色葡萄球菌计数结果为0.2～110 cfu/g。49株金黄色葡萄球菌中22株金黄色葡萄球菌肠毒素阳性,阳性率为44.90%。6株沙门菌血清分型分属4个血清型:肠炎沙门菌、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌、德尔卑沙门菌。6株沙门菌对头孢唑啉、头孢替坦、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素均耐药,3株沙门菌对氨苄青霉素/舒巴坦、头孢曲松、氨曲南、呋喃妥因和复方新诺明的耐药率均为33.33%,对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均为16.67%。结论 河南省市售生制速冻面米制品存在沙门菌和金黄色葡萄球菌的污染,其中沙门菌的检出率较低,但其安全风险较大；金黄色葡萄球菌虽未超标,但其检出率和肠毒素的阳性率均较高,应高度重视。     

磁珠法提取植物蛋白饮料DNA

目的 建立一种快速、高效的植物蛋白饮料基因组DNA提取方法并应用于植物蛋白饮料中植物源性成分的检测。方法 以豆浆、豆奶、芝麻糊、花生牛奶、榛子乳5种植物蛋白饮料为研究对象, 建立利用硅羟基磁珠提取植物蛋白饮料DNA的方法, 通过分析所提取DNA的浓度和纯度, 实时荧光PCR扩增效率, 并与十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)比较, 综合评价磁珠法提取植物蛋白饮料的效果。结果 大部分样品磁珠法提取的DNA浓度比CTAB法高, ODA260/A280均大于1.70。 结论 磁珠法提取的DNA纯度较高, 杂质少, 能满足植物蛋白饮料源性成分的分析要求, 尤其适用于大豆类蛋白饮料的DNA提取, 为快速、高效获取质量好的植物蛋白饮料基因组DNA提供参考。     

金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的优化

实验分别采用CTAB法、碱法、改良型碱法、改良型SDS法等提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,比较其提取质量,对金黄色葡萄球菌总DNA提取方法进行优化,以便高效、节约的应用于聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学研究。结果表明:改良型SDS法稳定性好,能够有效破壁,DNA的质量高,A260/A280为1.76,介于1.75~1.85之间。提取所需时间较少,仅需40 min,有利于金黄色葡萄球菌总DNA高效、快捷的提取。     

凉茶中DNA提取方法的建立

以凉茶植物源性饮品为研究对象,比较了1种硅胶柱法商品试剂盒和传统CTAB法提取凉茶食品基因组DNA的效果;通过紫外分析法和实时荧光定量PCR法对所提取的DNA进行检测,比较所得DNA的浓度和纯度,以及对下游检测的适用性。结果表明,与传统CTAB法相比,研究所建立的方法提取到的DNA无PCR抑制剂,浓度和纯度能满足后续PCR检测要求。     

2011~2019年吉林省米面制品中食源性致病菌监测分析

目的 了解米面制品中食源性致病菌的污染情况,为米面制品食物中毒的原因和影响因素提供线索。方法 根据《国家食源性疾病监测工作手册》对2011—2019年吉林省九个地(市)级所采集到的米面制品食品样本中蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌进行检测。结果 2011—2019年共检测米面制品3967份,其中阳性菌株313株,总检出率为7.89%,2015年检出率最高(14.68%)；蜡样芽孢杆菌在白山市检出率最高(44.44%),金黄色葡萄球菌在白城市检出率最高(44.44%),单增李斯特菌在白山市检出率最高(6.21%)；餐饮服务环节总阳性检出率为9.72%,流通环节总阳性检出率为5.38%；蜡样芽孢杆菌在炒的米面制品中检出率最高(43.42%),金黄色葡萄球菌在速冻面米生制中检出率最高,单增李斯特菌也是在速冻面米制品中检出率最高(14.29%)。结论 吉林省各地市米面食品污染的情况普遍存在,白山市最严重,但是近年来污染情况正在逐步好转速,餐饮服务环节需加强管理,小吃店,零售加工店和百货商场应该给予更严格的把控,速冻米面制品生制污染相对严重,需给予重视。     

速冻水饺中金黄色葡萄球菌污染调查及安全性分析

目的:检验速冻水饺中金黄色葡萄球菌的污染状况,依据调查结果对新版速冻米面制品食品安全国家标准(GB19295-2011)进行评价。方法:根据GB19295-2011规定,使用金黄色葡萄球菌平板计数法进行试验。结果:52批速冻水饺产品中(三级取样法n=5,共260件样品),有18批次检出金黄色葡萄球菌,批检出率为34.6%。在检出的阳性产品中,全部数据均在标准限量之内,产品合格率为100%。结论:新版国家标准在控制金黄色葡萄球菌污染方面更具科学性和合理性。     

速冻食品行业问题不断速冻面米制品新国标备受关注

11月7日,广州市工商局公布的2011年第三季度流通环节速冻食品抽样检验情况分析显示,在速冻面米食品、速冻肉（鱼）丸两类中共检出14批次金黄色葡萄球菌不合格。其中,郑州三全股份食品有限公司及其子公司生产的4个批次速冻水饺检出致病菌金黄色葡萄球菌。     

金黄色葡萄球菌到底有多可怕

近一段时间,由于新的食品安全国家标准《速冻面米制品》将金黄色葡萄球菌的限制数量由原来的“不得检出”改为限量检出,因此引发公众“要求降低了”的质疑和担忧,金黄色葡萄球菌成为国外内热议的话题。     

基于全自动核酸提取的荧光定量PCR鉴别羊肉制品真伪

摘要：目的 建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量PCR技术,提高羊肉制品真伪鉴别的检测效率。方法 分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PCR扩增结果评估不同方法的提取效果。以国标法为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果 与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15-30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样本中羊源核酸检出限为0.010 mg·g-1。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸PCR检测结果的CV值均<3.000%。分别采用三重实时荧光定量PCR法与国标法对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论 本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。     

速冻食品产业:冬天来了,春天还会远吗?

中国有句俗话,"好吃不如饺子",足见饺子在人们美食观念中的重要地位。但就在2011岁末,有"国内高端水饺第一品牌"之称的湾仔码头速冻水饺被检出金黄色葡萄球菌超标,这也是继思念和三全之后,国内速冻食品巨头再次身陷"超标门",且都是金黄色葡萄球菌超标。此事件的发生,正值新的食品安全国家标准《速冻面米制品(征求意见稿)》中金黄色葡萄球菌指标调整问题尚未定局之时,即将进行的标准修改再次引起舆情关注。正在市场普遍担心速冻食品是否将出现类似"三聚氰胺"般全行业危机时,《速冻面米制品》(GB19295-2011)新靴落地,并于2011年12月21日起正式实施。回顾这场新旧标准之争,消费者对金黄色葡萄球菌由"零容忍"改为"可限量检出"始终心存芥蒂。那么,新标准究竟是进步还是开倒车?它的制修订经历了怎样的一个过程?有哪些依据?今后速冻食品的安全保障工作该怎么做?《食品工业科技》与您一同关注。     

食品新国标三大疑惑

速冻水饺“金黄色葡萄球菌”标准之争、大企业“绑架”乳品新国标之争……2011中国食品行业的新国标制订，在质疑和争议中前行。“进退”之争：新国标是否“开倒车。今年以来，食品国家标准引发的争议屡见不鲜。在诸多知名品牌速冻水饺陷落“金黄色葡萄球菌门”后，新版速冻面米制品国标中将这一项目从“不得检出”改成“限量检出”，让众多消费者质疑标准“开倒车”。