实时定量PCR技术检测食品中花生过敏原Ara h1基因成分

采用Taqman探针PCR技术,建立食品中花生主要过敏原基因Ara h1的检测方法.根据GenBank提供的Ara h1基因(序列号AF432231)中一段DNA序列设计特异性引物与Taqman探针,扩增该目的基因,建立拷贝数-CT标准曲线,可通过标准曲线方程计算食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因拷贝数(copies),并用于检测8种食品中是否含有残留的该过敏原基因.此标准曲线在1.5×103copies～1.5×107copies范围内线性关系良好,R2值为0.9759;8种样品检测结果与食物过敏原标注内容相一致.     

重组花生过敏原Ara h 2生物合成

为获得重组花生过敏原Ara h 2。通过RT-PCR 合成cDNA,并以此为模板进行PCR 扩增目的基因Ara h 2,扩增产物经纯化后克隆至pMD19-T Simple 载体中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h 2。上述重组质粒经酶切纯化后定向克隆到pGEX-4T-1 表达载体中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-Ara h 2,并转化表达宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL 中,经IPTG 诱导表达。SDS-PAGE 电泳结果表明,该表达蛋白大小约为46kD,与理论值相符。通过Glutathione Sepharose 4B 凝胶亲和层析方法纯化融合蛋白GST-Ara h 2,获得融合蛋白纯度约为90%。Western blotting 分析表明,经纯化的融合蛋白能与抗Ara h 2 兔血清发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。     

花生过敏原Ara h7基因的克隆及序列分析

目的克隆花生Ara h7基因cDNA序列,并对其序列进行分析。方法采用Trizol法,从花生子叶中提取花生RNA,经反转录PCR,克隆花生Ara h7 cDNA序列;采用生物信息学软件对Ara h7序列进行分析,预测蛋白结构及功能。结果 Ara h7 cDNA序列有482 bp,编码160个氨基酸。生物信息学分析结果显示Ara h7蛋白是一种亲水性蛋白,分子量为18.881 kDa,具有9个潜在的磷酸化位点,5个不同的B细胞线性表位。结论本研究成功克隆了Ara h7 cDNA序列,并采用生物信息学软件分析了基因编码的蛋白的特征。     

花生中主要过敏原Ara h1的纯化

为了得到花生中引起过敏反应的主要致敏成分Ara h1,以新鲜花生为材料,通过粉碎、脱脂、硫酸铵分步盐析等方法进行粗提;并用离子交换柱以及凝胶柱等方法来进一步纯化过敏原Ara h1。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析了纯化后的过敏原Ara h1的纯度,并用高效液相色谱法测定其纯度达到90%以上。      

花生致敏蛋白Ara h1和Ara h2纯化鉴定方法研究进展

对主要花生过敏蛋白Ara h1和Ara h2的提取纯化方法以及纯化后Ara h1、Ara h2的鉴定方法进行了综述。     

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。     

超高效液相色谱-电喷雾质谱法检测花生 过敏原Ara h 2

目的建立烘培食品中花生过敏原Ara h 2的液相质谱联用定量检测方法。方法选择花生蛋白中的致敏蛋白Ara h 2作为目标蛋白,筛选出该致敏蛋白的特异肽,人工合成特异肽标准品和特异肽内标,从而建立直接检测花生致敏蛋白Ara h 2的准确定量方法。同时还对全国不同地区的20种花生中致敏蛋白Ara h 2的含量进行检测分析,初步统计得出致敏蛋白Ara h 2和花生蛋白的换算系数,并以Ara h 2作为生物标记物检测10种烘培食品中花生蛋白的残留量。结果花生样品中致敏蛋白Ara h 2的定量限为4.45μg/g,回收率在106.0%~107.8%之间。烘培食品中,定量限可达到6.23μg/g,回收率在107.0%~113.2%之间。结论本方法特异性强、灵敏度高、定量准确,具有良好的应用前景。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。     

动物肌肉组织DNA的提取方法及实时荧光定量PCR检测

以生鲜羊肉、猪肉、鸡肉、牛肉、鸭肉为实验材料,采用SDS法、异硫氰酸胍法、试剂盒法提取动物肌肉组织基因组DNA,对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR检测。结果表明,试剂盒法提取的基因组DNA在浓度和纯度方面均优于SDS法和异硫氰酸胍法。通过对三种提取方法建立的标准曲线进行比较,回归系数(R2)按照质量排序为:试剂盒法≥异硫氰酸胍法>SDS法,扩增效率按照质量排序为:试剂盒法>异硫氰酸胍法>SDS法。三种提取方法的羊源性成分灵敏度检测,最低检出限均为80 pg/μL,但在低浓度检测时试剂盒法的相对标准偏差RSD为0.684%,小于异硫氰酸胍法0.734%和SDS法1.075%;猪源性成分灵敏度检测,SDS法的最低检出限为80 pg/μL,异硫氰酸胍法和试剂盒法的最低检出限均为16 pg/μL,但在低浓度检测时试剂盒法的相对标准偏差RSD为0.092%,小于异硫氰酸胍法4.640%;鸡源性成分灵敏度检测,SDS法和异硫氰酸胍法的最低检出限均为3.2 pg/μL,试剂盒法的最低检出限为640 fg/μL,明显高于SDS法和异硫氰酸胍法。综上所述,试剂盒法提取的基因组DNA更有利于运用实时荧光定量PCR技术进行食物掺假和物种鉴别工作。      

花生主要过敏原Ara h1的纯化

采用硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析方法,纯化花生主要过敏原蛋白Ara h1,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合免疫印迹实验(Western-Blotting)进行鉴定。结果表明：可纯化出纯度90%以上的Ara h1过敏原蛋白。     

两种PCR方法检测食品中花生过敏原Arah1成分

采用套式PCR和荧光实时定量PCR两种方法检测食品中花生主要过敏原Ara h1基因成分,从而推断食品中是否含有花生过敏原成分。根据GenBank提供的花生主要过敏原基因Ara h1 DNA序列(登录号为AF432231)的中一段序列分别设计2对内外特异性引物,扩增目的基因片段来建立套式PCR方法;再用上述内引物扩增目的片段,建立SYBRGreenⅠ荧光实时定量PCR方法,绘出拷贝数-CT标准曲线;并通过这2种PCR方法检测8种食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因成分。套式PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法的标准曲线在3×102至3×108 copies范围内线性关系良好,R2值为0.993 5,检测低限设定为3×103 copies。2种方法检测8种食品样品,结果均与食物过敏原标注内容相符。本研究建立的2种方法具有快速、灵敏等优点,可用于食品中花生主要过敏原基因Ara h1成分的检测。     

离子交换层析法分离花生过敏原Ara h2的研究

为了制备出花生中重要过敏原Arah2,以生花生为材料,采用脱脂、离心、膜透析、离子交换层析等方法,纯化花生过敏原Arah2。结果显示,采用阴离子交换层析方法,制取的Arah2蛋白纯度达90%,得率为21.9%,该方法为过敏原Arah2的分离研究提供了可行的实验参数。     

实时荧光P C R 法检测食品中芝麻过敏原成分

本实验探讨采用实时荧光定量PCR 方法检测食品中的芝麻成分,结果表明：采用芝麻的引物和探针进行扩增时;22 种样品经实时PCR 扩增,只有白芝麻和黑芝麻产生荧光信号,其余样品均不产生荧光信号。灵敏度实验结果表明能检测到10-5 稀释度的4.4 ×10-12g DNA的量,定量关系式为：y=－ 3.472018x+18.851009,R2=0.993088。这两对引物和探针具有极高的灵敏度和扩增效率,符合痕量检测要求。     

基于焦磷酸测序的花生过敏原基因ara h6检测技术研究

应用焦磷酸测序技术建立了检测食品中花生过敏原基因Ara h6的快速检测方法,该检测方法对花生过敏原成分具有很好的特异性和重现性,测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,表明目标序列能够作为鉴定花生过敏原成分很好的特征序列,为食品中的花生过敏原成分快速检测提供良好的技术支撑,保证了食品进出口和食用安全。     

还原协同加热处理对花生过敏原Ara h2结构及抗原性的影响

花生过敏能引起荨麻疹、呕吐甚至休克等症状,通常是终生性过敏。本研究运用加热处理、半胱氨酸还原对Ara h2进行单独和复合处理,采用圆二色谱、紫外扫描光谱、间接竞争酶联免疫吸附法分别检测蛋白加工前后的结构与抗原性变化。结果显示,单一的加热和半胱氨酸还原处理过的蛋白结构与抗原性只发生部分变化。而复合处理中,在加热条件下,半胱氨酸还原蛋白的能力明显增强,还原后的蛋白二级结构与三级结构发生大幅变化,抗原性显著降低。研究结果表明,二硫键对于蛋白Ara h2结构稳定具有重要作用,二硫键被还原和加热过程破坏后,蛋白的抗原性和结构即发生重大变化。还原协同加热处理有望大幅改善2S球蛋白的结构和致敏性,可以作为蛋白脱敏加工的备选方法。     

大豆卵磷脂DNA的提取方法及应用

以大豆卵磷脂为研究对象,比较了CTAB法、磁珠试剂盒法以及硅胶膜试剂盒法等3种DNA提取纯化方法。通过大豆内源基因Lectin实时荧光PCR检测,发现CTAB法提取的大豆卵磷脂DNA质量优于其它两种方法,并以CTAB法为基础进行条件优化,进一步提高DNA纯度。采用该方法对6个不同品牌的市售大豆卵磷脂产品进行转基因成分(CAMV35S启动子及NOS终止子)检测,结果证实均不含转基因成分。