恶臭假单胞杆菌发酵条件的优化

在已筛选出产海藻糖合酶菌株———恶臭假单胞杆菌的基础上 ,研究了该菌株的发酵条件。实验结果表明 ,最佳发酵工艺条件为 :发酵温度 3 0℃ ,发酵pH 7 2 ,最佳通风量 10 0mL培养液 /5 0 0mL三角瓶 ,发酵终点为发酵后 5 2h。     

恶臭假单胞菌透性化细胞海藻糖合酶的酶反应工艺及其特性研究

用甲苯对恶臭假单胞菌细胞进行透性处理,研究了透性化细胞海藻糖合酶的酶反应工艺及其特性。研究结果表明,该细胞酶的最适反应条件为pH7.8,转速180 r/min,温度为40℃,反应时间为8 h。透性化细胞海藻糖合酶具有极强的底物特异性,激活离子有Na+、K+,重金属离子强烈抑制菌体生长和酶活。     

中村芽胞杆菌壳聚糖酶在大肠杆菌中重组表达及酶学性质

壳聚糖是一类来源丰富的大分子聚合物,在化工、食品、生物等多个领域都有广泛的应用价值,然而,只有降解成小分子的低聚糖才能更好地发挥其活性。随着酶法降解壳聚糖相较于其它方法的优势愈来愈明显,探索新型稳定高效的壳聚糖酶引起研究者的关注。参考GeneBank数据库中中村芽胞杆菌(Bacillus nakamurai)的壳聚糖酶氨基酸序列设计相应的编码基因,利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化重组蛋白。酶学性质研究结果显示:该酶在最适温度37℃,46℃处理30min时仍有50%的相对酶活,最适pH值4.5。在pH 2.5条件下处理60 min时,仍可保持60%相对酶活。Ag⁺、Hg⁺完全抑制酶活性,Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活性有促进作用,K⁺、Na⁺、EDTA对酶活性无明显作用。本文首次研究来源于中村芽胞杆菌的壳聚糖酶的酶学性质,以拓展该酶库资源,为该酶后续研究和应用提供理论依据。     

恶臭假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶发酵条件及特性的研究

对恶臭假单胞菌N0705产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件及部分酶学性质进行了研究.结果表明,在培养温度28℃,培养基初始pH值为6.6,接种量4%,装液量40mL/250mL,发酵时间50h时,精氨酸脱亚胺酶酶活最大.精氨酸脱亚胺酶发酵粗酶液在温度37℃及pH 6.0～7.0时有较好的稳定性.     

嗜糖假单胞菌麦芽四糖淀粉酶的枯草芽孢杆菌表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是淀粉酶中第3种外切型酶,可以顺序地从淀粉非还原性末端依次切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。该研究采用含有P43启动子和SacB信号肽的pWB980枯草芽孢杆菌表达载体,连接嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖淀粉酶基因,获得了重组菌pWB980-G4/1A747,实现了麦芽四糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的外分泌表达,并具有生物学活性。对表达产物进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶可广泛作用于7种不同来源的淀粉,生成单一产物麦芽四糖。最适反应温度为50℃,最适pH为7.0。进一步对pWB980-G4/1A747菌株进行发酵条件优化,得到其最佳活化时间为5 h,接种量为5%(v/v),通气量为20 mL/150 mL,培养时间为24 h,培养温度为37℃。     

进口肉类中恶臭假单胞菌的分离与鉴定

目的选择具有较高选择性的培养基,分离与鉴定进口肉类中恶臭假单胞菌。方法参照GB4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学沙门氏菌检验》、SN/T2099-2008《进出口食品中绿脓杆菌检测方法》,根据VITEK2显示的结果做生化鉴定。结果在选择性较高的沙门氏菌显色培养基上生长的菌落形态与沙门氏菌极为相似,VITEK2显示结果为恶臭假单胞菌,后经生化鉴定,结果与VITEK2一致,为恶臭假单胞菌。结论沙门氏菌显色培养基难以区分假单胞菌,但是亚硫酸铋琼脂(bismuth agar,BS)却可以明显区分,所以在日常检测过程中建议不要省去BS平板,在配制BS平板时需严格按照说明进行,以保证实验效果。     

硝基还原假单胞菌谷氨酰胺酶的分离纯化及酶学性质

采用离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,分离纯化硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004所产的谷氨酰胺酶,并进一步研究该酶的酶学性质及反应动力学参数。结果表明,该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为9.0,温度稳定范围为37～60℃,pH稳定范围为5.0～11.0;Cu2+对促进酶活提高作用最大,而Fe3+会抑制该酶的转移活力。谷氨酰胺酶对底物谷氨酰胺的亲和力最强,其Km值为0.72 mmol/L,Vmax为0.55μmol/(min.mL)。     

肌酐酶在大肠杆菌中外源表达及发酵优化

肌酐酶(creatininase, CA)是一种应用于体外检测试剂的重要工具酶,目前主要由微生物法生产,存在产量低和活性差的问题,限制了其实际应用。该研究通过全基因合成和异源表达构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-CA,获得了高性能CA。通过单因素试验和响应面设计分析确定最优培养基组成,并系统地优化了发酵条件,从而提高了CA表达量。培养基优化实验结果表明,最优培养基各组分为：葡萄糖10.33 g/L、酵母浸粉21.80 g/L、磷酸盐137.63 mmol/L和胰蛋白胨15.60 g/L。经过5 L发酵罐发酵工艺优化,极大地提高了CA的活力,在接种量4%、诱导温度25℃、诱导时间18 h、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度0.2 mmol/L、溶氧值30%条件下,其活力达到470.24 U/mL,比酶活力为367.38 U/mg。该研究为CA的生产和工业化应用提供了理论基础和技术支持。     

恶臭假单胞菌发酵条件的研究

从未发病的K326烟株根际土壤中筛选出对TMV具有高度拮抗活性菌株A3,发酵液的抑制效果可达95%以上,为此,从碳源、氮源、pH、温度、通气量及发酵时间等方面对该菌株的摇瓶发酵条件进行研究。结果表明,A3菌株发酵适宜温度为28 ℃,在该温度下发酵60～70 h达到菌体最大数量,且抑菌效价最高;以葡萄糖为适宜的碳源可以更好的促进菌量的生长和抗病毒物质的分泌,有机氮中酵母膏或蛋白胨对菌株的生长和抗病毒活性成分生成均能达到理想的效果,鱼粉则不能被A3菌株很好的利用;pH 7是菌株最适宜的发酵范围,偏酸不利于菌株的生长;适当加大通气量能更好地促进A3菌株的繁殖及抗病毒物质的分泌。     

黑曲霉木聚糖酶在大肠杆菌中的胞外表达和酶学性质研究

木聚糖酶能催化木聚糖分解为低聚木糖和木单糖,对于木聚糖高效利用具有重要意义.该研究将黑曲霉(Aspergillus niger)AG11来源的 β-D-1,4内切木聚糖酶(β-D-1,4 endoxylanase,xynA)分泌表达于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),并进行了表达条件优化和...     

大肠杆菌色氨酸酶的制备及酶学性质

以硫酸铵沉淀法分离提取大肠杆菌色氨酸酶,进行色氨酸酶学性质检测及动力学初步探讨。结果表明：使用50℃水浴法进行细胞壁的破碎,提取粗TPase 酶液效果较好;(NH₄)₂SO₄ 粗提色氨酸酶有较好效果;色氨酸酶的最佳反应pH 值为8.0,在pH5.5～7.5 较稳定;最高耐受温度65℃,最佳反应温度45℃;K⁺、NH⁴⁺ 能够明显地提高色氨酸酶活性,而Na+ 则明显地抑制酶活性。对色氨酸酶的动力学研究表明,在相同反应条件下,针对底物L- 丝氨酸的米式常数Km 值远远大于吲哚的Km 值。     

大肠杆菌工程菌产木聚糖酶工艺优化及酶学性质研究

对大肠杆菌工程菌产木聚糖酶的工艺进行优化,并对木聚糖酶的酶学性质进行研究。确定了提取工艺路线,即依次经过细胞破碎(高速珠磨法)、固液分离及除菌(中空纤维膜过滤)、超滤浓缩及烘干包衣步骤后得到肠溶木聚糖酶产品。该产品热稳定性好,在pH 2.5磷酸盐缓冲液中释放度为5.0%,在pH 5.5磷酸盐缓冲液中释放度为98.5%,产品外观光泽性好,能够很好地满足饲料酶市场要求。该木聚糖酶的最适pH值为6.4,最适温度为55℃。该酶具有较好的热稳定性,含水分17%的酶在90℃条件下2.5min仅失活13.6%。对木聚糖酶降解产物进行检测表明该木聚糖酶是一种内切酶。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

大肠杆菌O157:H7与假单胞菌混合菌膜形成时交互作用及其对毒力基因表达的影响

以大肠杆菌O157:H7和食品中常见腐败菌假单胞菌为对象,研究两种菌混合培养时菌体泳动能力和混合菌膜形成时的交互作用,进一步采用反转录实时定量聚合酶链式反应分析大肠杆菌O157:H7代表菌株在混合菌膜形成时毒力基因（stx1、stx2、hly和eae）表达变化。菌体泳动性结果显示,3 株大肠杆菌O157:H7泳动性均低于4 株假单胞菌（P＜0.05）,两种菌混合培养时假单胞菌的泳动能力受到显著抑制。选择性培养计数发现混合菌膜形成72 h时,两种菌未发生相互促进,其中4 株假单胞菌的菌膜形成均受到3 株大肠杆菌O157:H7显著抑制（P＜0.05）。选取大肠杆菌O157:H7 CICC21530菌株分析毒力基因表达,结果发现混合菌液单位体积、混合菌膜单位面积4 种毒力基因表达分别低于单种菌液、单种菌膜（P＜0.05）,进一步的单位菌数结果亦然,表明混合培养和混合菌膜形成时假单胞菌抑制了大肠杆菌O157:H7毒力基因表达;单位菌数结果还发现菌膜中4 种毒力基因表达均高于浮游菌（P＜0.05）,表明形成菌膜后菌体毒力增强。本研究可为揭示食源性致病菌和腐败菌混合菌膜形成的交互作用及进一步风险评估和风险防控提供科学依据。     

二烯丙基二硫醚对产志贺毒性大肠杆菌毒力基因表达及生物学特性的影响

以二烯丙基二硫醚(DADS)为原料,以非O157产志贺毒性大肠杆菌CICC10670为供试菌,通过测定最低抑菌浓度探究DADS对大肠杆菌的抑菌活性,利用实时荧光定量PCR技术测定大肠杆菌stx2、eaeA和ehxA基因表达的影响,DADS作为抑制剂探究其对大肠杆菌游动能力的影响。结果表明:DADS对大肠杆菌有较好的抑菌能力,其最低抑菌浓度为2 mmol/L。亚抑菌浓度下DADS降低大肠杆菌毒力基因stx2、eaeA和ehxA的表达,相对表达量降低85%以上,并呈现浓度依赖性。DADS以剂量依赖的方式在亚抑菌浓度下抑制大肠杆菌游动能力。综上所述,二烯丙基二硫醚对产志贺毒性大肠杆菌有良好的抑菌作用,并且较低浓度下就可抑制相关毒力基因的表达,可作为潜在的天然防腐剂,防止食物中毒,延长食品的货架期。     

淫羊藿苷糖苷酶的纯化及其酶学性质的研究

对由菌株Absidiasp.E9r在发酵培养中产生的淫羊藿苷糖苷酶进行了分离纯化并对其酶性质进行了研究。结果表明,该酶的分子质量约为65ku,酶反应的最适温度和pH值分别为50℃和4.0,在20～60℃,pH3.0～6.0条件下稳定性较好;金属离子Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+对酶反应的影响不大,而Fe3+、Cu2+对其有很明显的抑制作用;酶反应动力学研究,Vmax=3.012mmol/(L.h),km=58.59mmol/L。     

新型中性植酸酶在大肠杆菌中的高效表达、纯化及酶学性质

运用基因工程技术,将克隆到的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061新型中性植酸酶基因(GenBank登录号为HM747163)构建到表达载体pET22b(+)上,并在E.coli BL21(DE3)中进行高效表达。电泳结果表明该酶分子质量约为42kD,目的蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白30%左右。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化,酶学性质研究表明,其最适温度为60℃,最适pH值为7.0,最大酶比活力为15U/mg。60℃时以植酸钠为底物的Km值为0.30mmol/L。