有机溶剂原位萃取法提高悬浮培养中国红豆杉细胞紫杉醇产量

The production of paclitaxel from suspension culture of Taxus chinensis var,mairei was improved by in situ extraction with organic solvents to avoid feedback repression and product degradation.Oleic acid and dibutyl phthalate were proved to be suitable solvents .The optimal volumetric percentage of organic solvents in the culture medium was found to be around 8%,and the favorable time for their introduction was at the exponential phase of cell growth,Paclitaxel production with the in situ extraction was ca 3-fold of that without extraction.     

硝酸银作用下南方红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇动力学研究

研究了诱导子硝酸银对红豆杉细胞培养生产紫杉醇的影响,表明１０μｍｏｌＬ＾－１的硝酸银量有利于紫杉醇的生成,并通过动力学模型对硝酸银的作用位点进行分析,确定了硝酸银在紫杉醇代谢路径中的作用位点位于ＢａｃｃａｔｉｎⅡ和紫杉醇之间。     

外加紫杉醇后南方红豆杉细胞的耐受性及其凋亡的研究

利用显微照相和DNA提取等技术，研究了外源紫杉醇作用于服浮培养南方红豆杉细胞（Taxus chinensis var.Mairei)的凋亡和对紫杉醇（taxol）的耐受性。利用荧光显微照相技术观察到，外源紫杉醇作用下，随培养时间延长，南方红豆杉细胞发生明显核分化，应用DNA电泳观察到细胞DNA断裂形成典型的180bp及其整数倍梯形条带（DNA.ladders) ,应用TUNEL检测发现DNA的3'-OH断端可被特异性标记，证实了加入紫杉醇后南方红豆杉细胞发生了凋亡。研究结果说明南方红豆杉细胞对紫杉醇的耐受性是有限度。并证明了植物细胞有类似于动物细胞的凋亡特征，也表明该体系可以作为研究植物细胞凋亡的实验模型。     

电刺激对红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇的影响

以红豆杉悬浮培养细胞为材料产紫杉醇,在细胞生长的不同时期分别用脉冲电刺激及微交流电刺激处理。结果表明,两种电刺激均不同程度促进了红豆杉悬浮培养细胞的生长、紫杉醇的产生,其中脉冲电刺激效果优于微交流电刺激。最佳作用时间是在红豆杉细胞生长的衰亡期,微交流电刺激的紫杉醇含量较对照提高3倍多,脉冲电刺激的紫杉醇含量约为对照的7~9倍,最高达到12.24 mg.L-1。脉冲电刺激可有效提高紫杉醇的胞外释放率,达对照的4~5倍。     

真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞次生代谢的影响

在悬浮培养的南方红豆杉细胞体系中 ,细胞进入指数生长期末期时 ,加入真菌诱导子 (即尖孢镰刀菌胞壁成分的粗提出物 ,其主要成分为糖类和多肽 ) ,对几个主要的细胞次生代谢指标进行了监测 .实验结果表明 ,诱导子引起了南方红豆杉细胞次生代谢结构的变化 ,胞内酶蛋白的含量呈先上升后下降的趋势 ,而胞外酶蛋白的含量显著上升 ;苯丙烷类代谢途径中重要的酶PAL的活性显著升高 ;次生代谢产物中 ,酚类物质的含量增加 ,且于 4天后急速上升 ,同时多酚氧化酶的活力也加强 ,萜类产物中紫杉烷类的生物合成均得到了加强 ,其中紫杉醇的含量得到了大幅度的提高 ,达到对照组的 5倍左右 .     

红豆杉细胞两液相耦合培养过程中细胞凋亡与紫杉醇含量的关系

以油酸作为有机相与改良B5液体培养基组成耦合培养体系 ,研究了在该体系中悬浮培养的红豆杉细胞凋亡与紫杉醇含量的关系 .结果表明 ,紫杉醇的总含量随凋亡率呈抛物线规律变化 ;耦合培养法有效地促进了胞内紫杉醇向胞外释放 ,绝大部分储存于有机相中 ,从而降低了紫杉醇影响细胞凋亡发生的可能性 ,因此推测是细胞凋亡促进了紫杉醇的大量合成     

果糖补料与真菌诱导对红豆杉细胞悬浮培养体系的协同效应

研究了果糖补料和真菌诱导对南方红豆杉细胞悬浮培养体系中细胞生长状态和紫杉烷合成的协同作用。结果表明果糖补料和真菌诱导子的协同作用引起细胞的生理状态发生改变 ,培养基碱化 ,细胞的生物量有一定程度的降低 ,而表征酶含量的蛋白质含量有明显的提高 ,酚类物质大量积累 ,目的产物紫杉醇 (Taxol)被大量合成 ,其产量在摇瓶和反应器体系中最高分别达到 81.0mg/L和 71.7mg/L。     

剪切力对南方红豆杉细胞悬浮培养的影响

考察了流体剪切力对南方红豆杉悬浮细胞线粒体活性、膜透性、培养液pH、酚积累以及氧迸发等的影响. 结果表明，指数后期或稳定前期的南方红豆杉细胞对剪切力更为敏感，细胞生物活性丧失较大，次生代谢物酚的积累更多；此外，剪切力还引起了红豆杉细胞的防御应答反应，如H+内流、酚类物质大量积累以及活性氧迸发.     

南方红豆杉细胞两液相培养过程动力学

建立了摇瓶中南方红豆杉细胞两液相培养过程动力学模型 ,提出的有机溶剂毒性参数 1 0 /lgP使建立的模型不仅能确切反映两液相培养细胞生长和紫杉醇生产随时间、不同的有机溶剂 (烷烃、有机酸、醇和酯 )和有机溶剂体积分数等的变化规律 ,而且将有机溶剂毒性参数 1 0 /lgP取为 1、有机溶剂体积分数取为 0时模型可确切反映单液相培养细胞生长和紫杉醇生产的变化规律 .根据模型求解和结果分析 ,深入研究了这些变化规律的机理 .     

剪切应力对红豆杉细胞悬浮培养的影响及CFD模拟研究

在同轴圆筒装置的均匀剪切场中研究了不同剪切应力(0.16, 0.46, 0.78Pa)对悬浮培养的南方红豆杉细胞生理的短期影响。结果表明剪切应力为0.16~0.46Pa时,有利于细胞的生长和初生代谢;剪切应力为0.46~0.78Pa时, 有利于细胞的次生代谢;另一方面利用计算流体力学(CFD)对20L生物搅拌釜(45-斜向上桨(45-PBT),桨距为(1/3)T的流场进行了三维模拟,获得搅拌釜内部的剪切场。结果表明搅拌釜内剪切应力分布极不均匀, 且主要集中在搅拌桨区和尾流区,约为主流区和挡板区值的3~5倍,有时甚至高达7倍。通过将实验结果和CFD模拟相结合,预测了20L生物搅拌釜剪切应力对南方红豆杉细胞生理的影响。表明当搅拌转速小于150 rmin-1时,搅拌釜内相应的剪切应力有利于细胞的生长和初生代谢;而当搅拌转速大于200 rmin-1时,则不宜于南方红豆杉细胞的培养。     

磁场对水杨酸诱导下红豆杉紫杉醇产量的影响

研究了电磁场对水杨酸(SA)诱导下悬浮培养的南方红豆杉细胞的生长和紫杉醇产量的影响。结果表明在磁场强度为3.5 mT直流稳恒磁场下细胞活力、生物量和胞内蛋白含量均有明显升高;培养液碱化加剧;胞内苯丙氨酸转氨酶(PAL)活力峰值及胞外酚累积均提前。磁场作用后紫杉醇的产量第2天出现大量累积;最高产量出现在第6天,比SA单独处理组提前2天,但产量有所降低。     

HPLC法分析南方红豆杉植株中紫杉醇的分布规律

采用高效液相色谱法对野生和人工栽培南方红豆杉约20年生植株各器官、组织中紫杉醇含量进行检测分析后发现,紫杉醇在南方红豆杉植株中具有极显著向下、向根际积累分布的规律。野生和载培红豆杉,在器官水平,从上部枝叶到根部须根,紫杉醇的积累分别为 0.007 61 %~0.100 54 %和 0.015 25 %~0.061 75 %(干重,质量分数,下同);在组织水平,从形态学上部到根部,木质组织中紫杉醇积累分别为 0.010 95%~0.044 76 %和0~0.017 58 %,周皮组织中紫杉醇的积累量也具有从形态学上部到下部增高的规律,在主枝皮中的含量分别为 0.013 32 %和 0.006 77 %,在根皮中的含量分别为 0.086 33 %和 0.059 74 %。野生南方红豆杉中紫杉醇产量比人工栽培的要高。分析过程中紫杉醇在21~105 mg/L范围内线性关系良好,r²为0.999,平均加标回收率为85.78%,相对标准偏差为1.03%。     

酸胁迫作用下悬浮培养红豆杉细胞的磁场生物学效应

研究了直流稳恒磁场对酸胁迫作用下悬浮培养南方红豆杉细胞生长和代谢的影响. 结果表明,磁场提高了红豆杉细胞的抗酸胁迫能力,细胞活力上升,生物量和蛋白含量明显升高,胞外多酚氧化酶(PPO)活力升高,酚类物质积累受到抑制. 在一定浓度的盐酸作用下细胞受到的酸胁迫越大,磁场的生物学效应越明显. 胞外pH值和电导率的变化说明磁场提高细胞抗酸胁迫的能力与其加速了物质的跨膜转运有关.     

微波提取红豆杉枝叶中多糖的工艺研究

在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法,优化了皖南红豆杉枝叶中多糖的微波提取工艺。研究了提取时间、微波功率、料液比和浸泡时间对红豆杉枝叶多糖提取率的影响,建立了影响因素与响应值之间的数学模型,确立最佳提取工艺。结果表明:皖南红豆杉枝叶中多糖的最佳提取工艺为:微波提取6.11 min,液料比为30∶1,浸泡时间为119.21 min,微波功率为6 kW。该方法为提高皖南红豆杉枝叶中多糖成分的提取提供了基础。     

皖南红豆杉枝叶中总黄酮抗肿瘤活性研究

以MTT法考察皖南红豆杉枝叶中总黄酮的体外抗肿瘤活性;以小鼠移植瘤模型测定总黄酮对荷瘤小鼠抑瘤率和腹腔巨噬细胞吞噬能力,研究其体内抗肿瘤活性和免疫调节作用。结果表明,总黄酮对S180细胞生长有显著抑制作用,呈现剂量依赖关系。体内试验表明,与生理盐水组相比,总黄酮对小鼠S180实体瘤有显著抑制作用（P〈0.01）,可提高荷瘤小鼠的脾指数。与环磷酰胺组相比,总黄酮可使荷S180实体瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力显著升高（P〈0.01）,提示其对小鼠无免疫抑制作用。     

南方红豆杉叶挥发性成分研究

分别以二氯甲烷和乙醚作溶剂并采用低温冷凝,同时蒸馏萃取南方红豆杉干叶挥发性成分,极性色谱柱（DB-WAX）气-质联机分析。鉴定出63种化合物,主要是脂肪族类（60.44%）,其次为芳香族类（6.56%）,而萜类化合物占比例很小（4.57%）。按两种萃取溶剂所得分析结果平均值,主要成分是十六烷酸（21.19%）,十四烷酸（8.87%）、亚麻酸乙酯（3.49%）。相比已有的关于南方红豆杉叶油成分分析的报道,新鉴定出己醛、2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、2,4-庚二烯醛、苯甲醛、苯乙酮、苯甲醇等34种有青香、花香、果香香气的微量或痕量低沸点化合物。所鉴定化合物以1,2-二氯苯为内标定量,总含量为88.16 礸/g红豆杉叶。