重组IL-17A耻垢分枝杆菌的构建及其对巨噬细胞表达炎症因子的影响

目的构建携带小鼠IL-17a编码基因的重组耻垢分枝杆菌(Recombinant Mycobacterium smegmatis,rMs),并研究其对巨噬细胞表达炎症因子的影响。方法双酶切质粒pET28a/mIL-17a和pMFA41,转化感受态E.coli TOP10,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMFA41/mIL-17a,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。分别以MOI为10∶1加入rMs、rMs+anti-IL-17A、Ms感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,并设PBS对照组。荧光定量PCR法检测转染细胞中β防御素-2(Defensinβ2,Defb-2)、巨噬细胞炎症蛋白(Macrophage inflammatory protein,MIP)-1α和MIP-2β基因mRNA水平;ELISA法检测细胞培养上清中MIP-1α、MIP-2β、IL-4及IFNγ蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pMFA41/mIL-17a经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白mIL-17A可与大鼠抗小鼠IL-17A单克隆抗体特异性结合,在相对分子质量约20 000处可见特异性反应条带;rMs组RAW264.7细胞中Defb-2、MIP-1α、MIP-2β基因mRNA水平较Ms组及PBS组明显升高(P<0.01);rMs组细胞培养上清中MIP-1α、MIP-2β、IL-4和IFNγ的蛋白浓度较Ms组及PBS组明显升高(P<0.01)。结论成功构建了表达具有生物学活性mIL-17A的重组耻垢分枝杆菌疫苗,该疫苗可有效促进体外培养的巨噬细胞表达MIP、Defb2、IFN-γ及IL-4,为新型疫苗的研发奠定基础。     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。     

猪干扰素γ的原核表达及抗血清的制备

目的原核表达猪干扰素γ(poIFNγ),并制备其抗血清。方法PCR扩增poIFNγ成熟多肽基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-poIFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价。结果重组原核表达质粒pET-28a-poIFNγ经双酶切和测序证明构建正确;重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达90%;制备的抗血清效价可达10-5。结论已成功地在大肠杆菌中表达了poIFNγ,并制备了较高效价的抗血清。     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化

目的构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性。结果重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶性形式表达;纯化后的重组融合蛋白纯度大于90%,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠白细胞介素-17及其shRNA重组表达质粒的构建

目的构建小鼠白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及其shRNA重组表达质粒。方法以小鼠脾脏细胞总RNA为模板,PCR扩增IL-17基因,并亚克隆至质粒pLVX-IRES-ZsGreen1,构建重组表达质粒pLVX-IL-17-IRESZsGreen1;设计并合成3对针对IL-17基因的shRNA序列和1对阴性对照shRNA序列,分别插入质粒pLVX-shRNA,构建重组干扰质粒pLVX-shRNA1、pLVX-shRNA2、pLVX-shRNA3和阴性对照质粒shRNAC,进行测序;用脂质体法将各重组干扰质粒分别与表达质粒共转染293T细胞,分为空白对照组、过表达组、shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组和shRNAC组,经荧光定量PCR和ELISA法分别检测各组细胞中IL-17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果 PCR扩增获得500 bp的目的基因,IL-17重组表达质粒及其shRNA重组质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;重组表达质粒转染293T细胞48 h后可见绿色荧光表达;过表达组IL-17基因mRNA及蛋白表达水平均明显高于空白对照组(P均<0.05),shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组IL-17基因mRNA和蛋白表达水平均明显低于shRNAC组(P均<0.05)。结论成功构建了小鼠IL-17基因重组表达质粒及其特异性shRNA表达质粒,并筛选出shRNA1,其对IL-17的表达具有最佳的抑制效应。     

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达

目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。     

结核分枝杆菌ESAT-6重组二聚体的表达、纯化及其在血清学诊断中的初步应用

目的表达和纯化结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),并探讨其在结核病血清学诊断中的价值。方法以HG856A核酸疫苗质粒为模板,经PCR扩增获得2×esat-6基因,克隆至pET-28a质粒,构建原核表达质粒pET2E6;转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;用Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白,并用Western blot鉴定其反应原性,ELISA检测其敏感性和特异性。结果ESAT-6重组二聚体以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的35%;纯化的rdESAT-6纯度可达95%,可与ESAT-6小鼠抗血清发生特异性反应;用于结核病血清学诊断的敏感性为30%,特异性为95.8%。结论已成功表达并纯化了rdESAT-6,可作为结核病血清学诊断或皮试检测用的抗原之一。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

翻译调控肿瘤蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA为模板,PCR扩增TCTP基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。His Trap FF层析柱纯化重组蛋白后,进行Western blot鉴定。结果克隆的目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为20 000,主要以包涵体形式表达;纯化后纯度为80%,可与兔抗人TCTP多克隆抗体特异性结合。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了TCTP,为进一步研究其在肿瘤等疾病发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。     

小鼠白细胞介素-18的克隆及在原核细胞中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-18(mIL-18)全长cDNA,并使其在大肠杆菌中表达。方法利用RT-PCR和巢式-PCR,从活化小鼠腹腔巨噬细胞中扩增成熟IL-18的全长cDNA。经双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pRSET-C,构建含T7启动子的原核表达载体pRSET-mIL-18。测序鉴定后,将重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和/或乳糖的诱导下,使重组质粒获得表达。结果重组质粒读码框及mIL-18的序列与预期一致,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析获得证实。结论已成功构建了原核表达载体pRSET-mIL-18,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵

目的原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵。方法全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因,克隆入pET22b(+)-X表达载体中,构建重组质粒pET22b-CecropinB-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,最后在5L发酵罐中进行发酵。结果酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Westernblot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c3T3细胞生长的活性,在5L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60g。结论已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础。     

乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2+-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。     

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。