黑曲霉N5-5单宁酶的纯化及酶学性质测定

采用中空纤维膜超滤和葡聚糖凝胶层析相结合的方法对黑曲霉N5-5单宁酶进行纯化,然后对纯酶性质进行测定。结果显示,黑曲霉N5-5单宁酶用该方法纯化后,可纯化近20倍,酶活力可回收23.30%。对纯酶作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可知黑曲霉N5-5单宁酶为分子质量64.2 k D的单肽链蛋白。纯酶的酶促反应最适温度为45℃,且在25~45℃范围内热稳定性良好;酶促反应最适p H值为5.0,且在p H 5.0~5.5范围内酸碱稳定性良好。另外,反应动力学测定结果表明,该酶对底物没食子酸丙酯的米氏常数K_m为0.916 mmol/L,最大反应速率vmax为0.877 mmol/(L·min)。     

Partial Purification and Characterization of Sulfhydryl Oxidase from Aspergillus niger

ABSTRACT: Sulfhydryl oxidase (SOX) was purified after extraction and the contaminating catalase activity was completely eliminated in the last chromatography step. A yield of 25% was obtained with a purification factor higher than 300. The isoelectric point was 3.7 and the molecular weight 110 kDa. SOX exhibited an optimal activity at pH 5.6 and its efficiency (V_mapp/K_mapp) increased from pH 4.5 to 6.5. At pH 5.6, the K_mappvalues were 0.5, 2.5, 10.5, 110, and 450 mM for GSH, cysteine, g-glu-cys, dithiothreitol, and homocysteine, respectively, and the V_mappvalues represented 2, 34, 24, and 44% of the V_maPPvalue found for GSH, respectively. Cys-gly was not oxidized by SOX. In the presence of GSH, SOX is able to catalyze the oxidation of cysteine and cys-gly at a significant rate.     

黑曲霉降酸菌株F1降解酒石酸关键酶的分离纯化

为得到黑曲霉菌株F1中具有降酸作用的蛋白,将黑曲霉菌株F1经酒石酸诱导发酵得到菌丝体,用液氮研磨破碎细胞壁,超声波辅助提取得到粗酶液,硫酸鱼精蛋白去除核酸,热变除杂蛋白,聚乙二醇浓缩,透析脱盐,DEAE-纤维素52阴离子交换层析,Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱分子筛层析,最终得到该蛋白的单一组分,其纯化倍数为14.32,并确定该酶为脱氢酶类。     

黑曲霉Z-25产葡萄糖氧化酶胞外酶发酵培养基优化研究

以黑曲霉Z-25(Aspergillus niger Z-25)作为葡萄糖氧化酶胞外酶生产菌株,研究提高胞外酶活力的环境因素.通过单因素试验,确定了主要影响葡萄精氧化酶合成的四个因素,采用四因素三水平L9(34)正交试验,确定了产葡萄糖氧化酶胞外酶的优化发酵条件:葡萄糖添加量为10%、(NH4)2SO4添加量为0.5%、月示蛋白胨添加量为1.5%、吐温80添加量为3%.在优化条件下,葡萄糖氧化酶的活力是优化前的242%.     

Characterization and Cheese-Making Properties of Rennet-Like Enzyme Produced by a Local Algerian Isolate of Aspergillus niger

An ochratoxin free extracellular acid protease was produced by solid state cultivation of Aspergillus niger FFB1. The purified enzyme (48.7 kDa) showed an optimal milk clotting activity at pH 5.5 and 45°C in the presence of 0.01 M CaCl₂. The enzyme was stable at least 24 h at 35°C in the pH range of 5.5–7.0. Thermal denaturation started above 45°C. Fresh cheese manufactured with reconstituted cow milk and the purified enzyme showed similar basic characteristics (pH 4.5, acid taste, white color) as marketed cheeses obtained with calf rennet. This emphasizes the value of exploiting local biological resources for value added food processing in developing countries.     

黑曲霉SL2-111产果胶酯酶的纯化与性质

通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Sephacryl S-200分子筛柱层析3个步骤,从黑曲霉SL2-111发酵的果胶酶粗品中纯化出一种电泳纯的果胶酯酶。经SDS-PAGE测定其分子质量约为48.8ku。最适pH值和最适温度分别为5.8和60℃。在50℃以下,pH值5.8-6.2之间酶活力相对稳定。     

黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究

以糖化酶活力为指标,通过单因素实验,分别考察了添加物、补料时间和补料量对黑曲霉发酵产糖化酶的影响。通过正交实验,考察了发酵条件对黑曲霉发酵产酶的影响。结果表明,添加0.4%的(NH4)2SO4作为促进剂可使酶活提高17%,最佳补料时间为48 h,补料量6 mL,补料可使发酵周期由原来的96 h延长到120 h;最佳发酵条件为接种量15%,250 mL三角瓶装液量50 mL,初始pH为4.5。     

黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究

本文针对黑曲霉液态发酵所产柚苷酶的分离纯化工艺及其酶学性质进行研究。将黑曲霉液态发酵所产酶液,依次通过30%~70%硫酸铵盐析、膜透析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析后得到高纯度柚苷酶。经SDS-PAGE凝胶电泳仅得到一条清晰条带,分子量约为65.10 ku。纯化获得的柚苷酶比酶活可达6932.54 U/mg,纯化倍数和酶活回收率分别为13.82倍和13.30%,并且能有效水解柚皮苷。进一步研究发现,该酶的最适反应p H为4.5,最适作用温度为50℃,在20℃~50℃及p H 3.0~6.0范围内有良好的稳定性。在一定浓度范围内,K+、Ca2+和Na+对柚苷酶活性有促进作用,而Fe3+、SDS和EDTA-Na2对其活性有明显的抑制作用。本研究为深入理解柚苷酶分离纯化过程,明确其酶学性质,进一步探索柚苷酶应用于天然活性产物生物转化过程的相关机制提供了基础数据,具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值。     

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质虾青素β-胡萝卜素角黄质β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al~(3+)和Fe~(3+)是该酶的强效催化剂,Fe~(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。     

黑曲霉496-1菌株植酸酶的分离纯化及酶学性质

黑曲霉(A.niger)496 1菌株所产胞外植酸酶,经透析浓缩、DEAE cellulose离子交换层析及SephadexG 75,Sephacryl100凝胶过滤,获得了2个植酸酶,其相对分子质量分别为64200及41100.该2个植酸酶的最适pH分别为6.0和3.0,最适温度分别为55℃和40℃.初步确定一个是中性植酸酶,另一个为酸性植酸酶.     

黑曲霉N5-5产单宁酶的酶学性质与固定化

本实验室自主分离的黑曲霉N5-5所产单宁酶已发现对没食子酸丙酯具有良好酶解效果。为了单宁酶的工业化应用,本次研究大批量培养单宁酶,探究其对单宁酸的酶解效果及酶的固定化效果。发酵采用先液体扩培后固体发酵的形式,提酶后利用陶瓷膜过滤技术纯化、浓缩酶液,并对比冷冻干燥和喷雾干燥两种不同干燥方式,还使用树脂载体对酶进行固定化。实验表明,纯化后单宁酶酶活达258.53 U/mL,可水解10%至50%浓度的单宁酸,其中30%以下底物浓度酶解效果较好;冷冻干燥对酶活影响不大而喷雾干燥使酶活降为174.02 U/mL;另外,单宁酶通过树脂载体固定化后,在实验条件下可重复使用至少4次。研究为提高黑曲霉N5-5发酵所产单宁酶的媒介效率、降低酶解反应成本、实现商业化生产建立了理论基础。     

黑曲霉酸性果胶裂解酶的高效表达及其在果汁澄清中的应用

利用黑曲霉自身强启动子（葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA）实现了酸性果胶裂解酶PelD在黑曲霉中的过量表达,重组酸性果胶裂解酶经镍柱亲和层析纯化后进行Western blot鉴定及酶学性质研究。重组酸性果胶裂解酶在摇瓶发酵条件下最高酶活力达到8?822.6?U/mL;经一步纯化后,该重组酶的比活力为8?522.7?U/mg,回收率为79.4%;该重组酶的最适反应pH值为5.0,在pH?3.0～6.5范围内40?℃保温2?h仍能保持50%以上的相对酶活力,在酸性pH值下稳定性良好;最适反应温度为50?℃,该重组酶在30～50?℃的范围内非常稳定;在1?mmol/L浓度下,Ca2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Mn2＋、Ba2＋对该重组酶具有激活作用,其中Zn2＋、Ni2＋、Ba2＋激活作用较为显著,而十二烷基硫酸钠表现为抑制作用;底物特异性分析表明该酶能够特异性地降解高度甲酯化果胶,其对柑橘果胶（酯化度≥85%）酶活力高达31?248.0?U/mL;此外,重组酶对橙汁、苹果汁和葡萄汁具有良好的澄清效果,其中橙汁的透光度提高了16.9?倍,苹果汁的透光度提高了10.5?倍,葡萄汁的透光度提高了4.7?倍。     

黑曲霉低聚葡萄糖氧化酶的分子克隆与生化特征

低聚葡萄糖氧化酶能够氧化低聚葡萄糖末端残基生成相应的低聚糖酸,在低聚糖酸的制备、食品、化工等方面具有潜在的应用价值。从黑曲霉基因组中发现1个疑似编码低聚葡萄糖氧化酶开放读框,共编码473个氨基酸序列,包含2个保守结构域(FAD结合域和黄素结构域)和4个活性位点(His80、Cys141、Asp377和Try428);在毕赤酵母中表达的重组酶蛋白大小为61 kDa,比酶活0.33 U/mg。重组酶的最适作用温度和pH值分别为75℃和9.0;在55～85℃和pH 5.0～9.0范围内孵育4 h,仍能保持70%以上的酶活;Mn²⁺和Fe³⁺分别对酶活具有最强的激活和抑制作用。该酶的K_m和V_max为0.48 mmol/L和2.22μmol/(L·min),对麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖具有相对较高酶活。     

一株酸性糖化酶的分离纯化及酶学性质研究

从土壤中筛选得到一株产酸性糖化酶的黑曲霉ASP-S21,粗酶液通过（NH4）2s04沉淀、Sepharose HP阴离子交换层析、SephacrylS-200层析柱分离纯化,SDS-PAGE电泳测定其分子量为120kDa。该酶最适作用温度为65℃;酶的最适反应pH值为4．0;在pH2．2-7．6之间,具有较好的酸稳定性;酶的Km值为0．94mg／mL,Vmax=142．43mol（Glu）／min-L。Cu2＋和Co2＋对酶活有较强的促进作用,10mM的Cu2镟酶活力提高到129％,Fe^3＋对酶催化活力抑制作用较强。该酶且具有部分降解生淀粉的能力,在pH4．0,50℃反应1h,生淀粉酶活力为0．39U,RDA值为4．57％。得到的黑曲霉ASP-S21酸性糖化酶,产生的糖化酶活力高、耐酸稳定性好,酶争陛质符合淀粉糖化工业化过程中对酶的要求,具有良好的研究前景。     

脉冲强光对黑曲霉细胞膜损伤及胞内酶活性的影响

通过脉冲强光处理黑曲霉菌悬液,研究菌体细胞膜通透性的变化以及胞内酶活性的变化。结果表明：经脉冲强光处理后菌悬液的蛋白质溢出量、丙二醛的漏出量与对照相比均有显著增加,透射电子显微镜观察到细胞膜和细胞壁表面凹凸不平,出现褶皱。此外,脱氢酶活力与另外胞内3种主要抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)活力也都有不同程度的下降。因此,霉菌屏障结构破坏所造成的细胞膜渗透压和通透性的变化可使霉菌胞内物质发生改变,甚至导致菌体死亡。     

黑曲霉单宁酶发酵工艺

用黑曲霉Aspergilhus niger QG 0301进行单宁酶发酵，制得酶制剂。实验结果表明：Aspergillus niger QG 0301进行单宁酶发酵的适宜培养基包括：混合碳源（或玉米淀粉）、硫酸铵、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁、单宁酸；在30℃、120r/min振荡培养5天，单宁酶产量平均为18．55u／mL。     

一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析

采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,属于一种半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶的最适温度为50?℃;最适pH值为6.5;稳定温度为40?℃;稳定pH值为7.0;Mn2＋促进蛋白酶活力,Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、K＋、Na＋抑制蛋白酶活力,以上金属离子对蛋白酶二级结构也产生不同程度的影响;米氏常数Km为2.43?g/L,最大反应速率Vm为103.09?mg/（L·min）。在5、10?g/100?mL和15?g/100?mL的NaCl质量浓度条件下,蛋白酶保留的酶活力分别为77.22%、54.39%以及41.15%。该蛋白酶在高盐度环境下保持较高的酶活力,因此具有潜在的工业应用价值。     

曲霉羧肽酶的分离纯化研究

采用 (NH4) 2 SO4、酒精、DE52 和SephadexG1 0 0对AspergillusspCP 1发酵液进行分离纯化 ,并检测在分离纯化过程中酶的回收率和比活力 ,最后用SDS PAGE电泳检验酶的纯度。确定 (NH4) 2 SO4饱和浓度在 60 %～ 90 %之间 ,酒精浓度为 3 5 %～ 70 %之间用于粗酶液的提纯 ;电泳得到一个清晰的条带。它们的分子质量约为 15 942u。     

Degradation of Ochratoxin A by Proteases and by a Crude Enzyme of Aspergillus niger

Ochratoxin A is a mycotoxin present in food commodities as cereals, wine, coffee, figs, dried vine fruits or beer and in feeds for animals. The enhancement of its conversion into ochratoxin α is considered to be a way to reduce its presence in the body and, therefore, its toxicity. In this paper we report the ability of several commercial proteases to hydrolyze ochratoxin A into ochratoxin α in different amounts. After an incubation period of 25 h., a significant hydrolytic activity at pH 7.5 for Protease A (87.3%), and for Pancreatin (43.4%) was detected. At pH 3.0, a weak hydrolytic activity was detected for Prolyve PAC (3%). None of the other commercial enzymes tested were able to hydrolyze ochratoxin A in the tested conditions. Also, the isolation of an enzyme extract from an Aspergillus niger strain with very strong ochratoxin A hydrolytic activity at pH 7.5 (99.8%) is reported. This activity is similar to the activity detected in Protease A. Data about the inhibition effect of ethylenediaminetetraacetic acid and phenylmethanesulfonyl fluoride on the involved hydrolytic enzymes showed that enzymes involved in ochratoxin A hydrolysis are metalloproteins.     

黑曲霉VVTP84生产果糖转移酶

从产果糖转移酶的 11株菌株中筛选出一株黑曲霉VVTP84菌 .该菌株在含蔗糖的培养基中 ,最佳摇瓶发酵时间为 30h ,pH值为 7.0 ;当蔗糖质量浓度在 2 5 0g/L以内时 ,产酶与蔗糖质量浓度呈正相关 ;MgSO4 ·7H2 O和KH2 PO4 的添加量分别以控制在 1.5 g/L和 1.0 g/L为宜