解脂耶氏酵母URA3基因的敲除

构建了营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株,使之用于遗传标记和高产香味物质γ-癸内酯.作者利用基因同源重组的方法敲除掉尿嘧啶合成酶关键基因URA3基因,用尿嘧啶营养缺陷型培养基(SD-URA)添加一定浓度的5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶筛选获得转化子.实验表明:尿嘧啶营养缺陷型菌株在含有5-FOA和尿嘧啶的培养基上生长而野生型菌株不生长,从而建立了一种快速获得营养缺陷型解脂耶氏菌株的方法.     

葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及发酵优化

葡萄糖氧化酶(β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase;EC 1.1.3.4,简称GOD)是生物领域中至关重要的工具酶之一,被广泛应用于食品工业、饲料工业、纺织、医药等行业中。作者构建了一株重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica 1-28,分泌GOD,并进一步运用单因素实验与正交实验在摇瓶水平对其发酵培养基进行了优化。实验结果显示,最佳发酵培养基配方为:甘油20 g/L,酵母膏2.64 g/L,氯化铵2.64 g/L,无水硫酸镁0.13 g/L,磷酸二氢钾0.32 g/L,维生素B13.34×10-4g/L,初始pH值6.0。优化后GOD发酵产量达到11.0 U/mL,较初始发酵培养基GOD产量提高了72%。在此基础上进行3 L罐发酵,重组菌在甘油补料30 g/L,pH为5.0时,28℃发酵190h,发酵液酶活达到81.6 U/mL。     

不同碳源培养下解脂耶氏酵母的转录组差异分析

以葡萄糖为碳源生长的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为对照组,以油酸为碳源生长的Y. lipolytica为实验组,利用Illumina高通量测序平台对两者进行转录组测序,通过多种生物信息学方法对数据进行分析处理。对照组的测序结果共得到17 923 921 clean reads;实验组的测序结果共得到22 656 852 clean reads。两个样品差异表达基因的分析显示共有536 个显著性差异表达基因,376 个基因表达上调,160 个基因表达下调。通过GO和KEGG富集分析可以了解这些差异基因参与的生物学调控。本研究为解脂酵母分子生物学的进一步研究提供了参考。     

常压室温等离子体诱变选育高产脂肪酶解脂耶氏酵母

采用常压室温等离子体(Atmospheric room temperature plasma,ARTP)对产脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株YL1进行诱变;通过三丁酸甘油酯平板法、p-NPP法以及酸碱滴定法等筛选得到高产脂肪酶的目标菌株C4,并研究其遗传稳定性。结果表明,解脂耶氏酵母菌株YL1的最佳诱变时间为60s,菌株致死率达97.45%;突变株C4的脂肪酶酶活为13.4 U/mL,较出发菌株提高了82.6%,多代培养后遗传稳定;与出发菌株相比,突变株脂肪酶可使维生素A棕榈酸酯的合成转化率提高36.9%。     

解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的研究

对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的酶反应体系进行了研究。实验发现解脂耶氏酵母全脂肪酶粉(105U/mg)在50mmol/L p H7.0 Tris-HCl(含7.5mmol/L黄胆酸钠),100mmol/L p H6.0磷酸钠缓冲液(含1000U脂肪酶)的体系中,水解产生阿魏酸的得率为2.94%。为了进一步提高脂肪酶水解效率,对解脂耶氏酵母脂肪酶中主要组分lip2脂肪酶基因进行了克隆,整合至毕赤酵母GS115基因组后发酵制取lip2脂肪酶粉(70.1U/mg),于上述酶解体系中进行水解谷维素实验。实验结果表明阿魏酸产率为2.87%。获得的lip2脂肪酶催化效率略低于全脂肪酶粉催化效率,但是获得了单一的脂肪酶基因,为进一步采取分子进化技术提高其催化能力奠定了基础。     

代谢工程改造解脂耶氏酵母生产油脂研究进展北大核心CSCD

微生物油脂是可再生能源发展的重要方向,近年来通过合成生物学方法和代谢工程技术改造,解脂耶氏酵母的产油水平提高迅速,展现了良好的应用发展前景。从代谢途径关键酶调控、负反馈调节解除、代谢途径关键酶异源表达、乙酰辅酶A和NADPH替代途径构建、强化氧化应激保护、促进脂肪酸分泌、适应性进化和计算机辅助模拟8个方面,梳理总结了代谢工程改造解脂耶氏酵母生产油脂的最新研究进展。通过对现有研究分析发现,廉价底物中的毒性成分影响细胞生长和油脂合成,以及油脂调控网络机制的不完全明晰,是限制解脂耶氏酵母油脂产量提升的主要障碍。为此,可通过设计引入解毒途径,添加解毒剂,或筛选毒性化合物耐受菌,以及利用多组学技术和计算机辅助优化进一步解析代谢调控机制解决此问题。此外,在“双碳”背景下,可在解脂耶氏酵母中引入高效的人造光合作用或碳固定途径,利用二氧化碳生产油脂。     

共轭亚油酸合成相关基因在耶氏解脂酵母中异源表达及活性研究

为了探究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中与共轭亚油酸(CLA)生物合成相关的3个基因:(亚)油酸水合酶基因(mcra)、短链脱氢酶/氧化还原酶基因(dh)、乙酰乙酸脱羧酶基因(dc)在耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica,Y.lipolytica)中异源表达后能否具有活性,利用两个耶氏解脂酵母整合表达质粒(p INA 1269和p INA 1312),将3个基因分别导入耶氏解脂酵母营养缺陷型宿主菌Polf(Ura~-,Leu~-)中,构建了重组菌株。在不同重组菌中添加相应的底物:亚油酸(LA)和10-羟基-顺12-十八碳烯酸(10-HOE),然后对反应体系进行脂肪酸检测,得到基因对应的不同产物:10-HOE和10-氧代-反11-十八碳烯酸(10-oxo-trans 11-octadecenoic acid),证明mcra、dh、dc在耶氏解脂酵母中进行了异源表达并且具有活性。     

食品检验用解脂耶氏酵母菌标准物质制备研究

目的 为满足实验室酵母菌日常检验质量控制需求及实验室间比对,制备解脂耶氏酵母菌检验用标准物质。方法 通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及ITS位点测序对研究用菌株进行菌种鉴定确认后,刮取适宜菌苔于保护剂中混匀后冻干,制备10_⁴ CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS-GL003等标准要求进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。将样品放于25 ℃和37 ℃及-20 ℃、4 ℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据国家标准GB 4789.15,将研制的本标准物质加入7类食品基质共20件样品中进行检验,验证真实食品样品中适用性。组织3家实验室,对本标准物质进行协作标定。结果CMCC98025经生化鉴定为解脂耶氏酵母菌,准确度为93%;MALDI-TOF MS鉴定结果为解脂耶氏酵母,分数为2.012;ITS位点测序结果与NCBI Genbank中已有序列比对,匹配最优结果为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica(Accession number ：CP061015.1;Query Cover：95%;Ident：100%)。均匀性测试结果符合正态分布,通过单因子方差分析计算F_0.05(19,20)=2.137,F值为1.697,F＜F_0.05,符合均匀性要求。25 ℃及37 ℃培养箱中放置7天,标准物质中菌含量仍保持在10_⁴ CFU/样品,可保持稳定。标准物质于4 ℃储存28天及-20 ℃储存90天,菌含量为10_⁴ CFU/样品,复苏率均在91%以上,说明4 ℃放置较短时间及-20 ℃放置较长时间样品稳定。7类食品样品基质中加入本标准物质后进行检验,均可检出,回收率为81.3%。经三家实验室协作标定,本标准物质平均浓度为2.0～3.0×10_⁴ CFU/样品。结论 本研究制备的解脂耶氏酵母菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于食品中解脂耶氏酵母菌定性检验,今后可作为实验室日常检验工作的阳性对照质控样品,也可作为实验室间比对样品发放,以保障日常检验工作结果可靠性,进一步提升检验机构人员的检验水平。     

尼罗红荧光光谱法快速测定解脂耶氏酵母油脂含量的研究

为了建立快速简便检测解脂耶氏酵母油脂含量的方法,探讨了尼罗红-光谱法测定解脂耶氏酵母油脂含量的检测条件。通过研究解脂耶氏酵母最佳发射光波长、细胞密度、尼罗红染液用量、染色时间、不同助溶剂效能及最佳体积分数对荧光强度的影响,确定了最佳检测条件,得到细胞油脂含量与荧光强度的线性关系。解脂耶氏酵母在激发光560 nm、发射光650 nm处有最高荧光值,每毫升菌液加入质量分数为0.1 mg/m L的尼罗红染液20μL,加入体积分数为15%的异丙醇,黑暗染色5 min,在细胞OD600=0¹.3的范围内,菌液的油脂含量（X）与荧光值（Y）呈较好的线性关系,线性关系式为Y=6.3651X+10.097,R2=0.9902,灵敏度达0.0001 g。该方法能够准确地反映出解脂耶氏酵母胞内油脂含量。尼罗红-荧光法可成为一种快速检测解脂耶氏酵母胞内油脂含量的新方法。      

溶氧对耶氏解脂酵母油脂积累和柠檬酸分泌的影响

产油耶氏解脂酵母能将培养基中过量的碳源转化为油脂储存于细胞内并分泌大量的柠檬酸。在耶氏解脂酵母发酵过程中通过关联搅拌转速和通气量调控培养基中的溶氧含量处于5%、10%、20%、30%和不控制5种水平,来研究溶氧对其油脂积累和柠檬酸分泌的影响。结果表明,随着发酵培养基中溶氧的增加,耶氏解脂酵母细胞内油脂含量和柠檬酸分泌量均有所增加,且不控制培养基中溶氧时,细胞内油脂含量和柠檬酸产量均最高,油脂含量达到细胞干重的11.62%(w/w),柠檬酸产量达到21.0 g/L。培养基中不同的溶氧含量还会影响油脂的脂肪酸组成,高溶氧能够促进油酸含量的增加,溶氧不控制时油酸的含量最高,达到48.62%。本研究为耶氏解脂酵母产脂发酵培养过程中溶氧的控制提供了重要的实验依据。     

超高压处理对泡椒凤爪微生物与品质的影响

将超高压技术（high pressure processing,HPP）应用于泡椒凤爪的加工过程,同时以传统热加工做对照,对处理前后以及贮藏期内微生物、理化指标和质构指标等进行研究。结果表明：热处理和超高压处理（400 MPa处理5 min）后泡椒凤爪菌落总数从21 000 CFU/g分别降到12 CFU/g和23 CFU/g,4 ℃和25 ℃贮藏15 d后,超高压处理样品的菌落总数分别增加到425 CFU/g和6 600 CFU/g,符合GB 2726-2005《熟肉制品卫生标准》要求。超高压处理组产品的硬度、脆度、弹性和感官评价指标显著高于热加工组。超高压处理组样品贮藏15 d后,亚硝酸盐含量低于GB 2726-2005的最高限定值。HPP技术适合应用在传统食品泡椒凤爪的生产过程中。     

泡椒凤爪加工过程中细菌群落组成及变化分析

该研究采用传统培养法结合高通量测序法分析了泡椒凤爪加工过程每一个步骤中细菌数量及群落组成的变化,以确定其加工过程中的主要污染及微生物组成情况。结果表明：Y5（切分）是重要污染环节,菌落总数增加至2.20×104 CFU/g。Y9（真空包装）菌落总数（30 CFU/g）较Y7、Y8增加,且细菌多样性最高（Shannon=7.82）,可能是真空包装过程给产品带来了一定的污染。Acinetobacter（不动杆菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）和Psychrobacter（嗜冷杆菌属）等是泡椒凤爪加工过程中的优势菌属,平均相对丰度分别为21.50%,9.29%,5.99%。而Y10（辐照杀菌后成品）中相对丰度较高的菌属包括具有一定的产蛋白酶和脂肪酶能力的Acinetobacter（不动杆菌属）（3.23%）、Serratia（沙雷氏菌属）（4.86%）、Staphylococcus（葡萄球菌属）（6.26%）和Bacillus（芽孢杆菌属）（4.59%）,其中部分菌属还包含致病菌株,在储藏及销售过程可能会给产品带来质量及安全问题。研究结果加深了对泡椒凤爪加工过程中微生物污染及群落组成的认识,可为后续泡椒凤爪微生物污染防控及产品品质和安全性提升提供一定的理论依据。     

高压诱变啤酒酵母研究及其突变株RAPD 分析

用高压技术对啤酒酵母生长影响进行研究,通过高压诱变获得突变株,并对啤酒酵母出发株和突变株发酵性能进行分析比较。利用随机引物对啤酒酵母出发株和突变株基因组DNA 进行RAPD 分析,从分子水平考察出发株与MS-3 之间的差异。结果表明：300MPa 保压15min 为最佳处理参数,处理对数生长期啤酒酵母筛选获得变异菌株MS-3。用20 条随机引物对出发株和突变株进行扩增,其中7 条引物对出发株和突变株扩增得到较多条带,有4 条引物出现变异的特征带,从而为利用高压诱变筛选啤酒酵母优良菌种提供初步依据。     

银耳干品的DNA提取及随机扩增多态性分析

银耳子实体中因含有大量的多糖和蛋白质,严重干扰其基因组DNA的提取。本实验建立一种银耳干品（子实体）中DNA的提取方法,利用此法可直接以银耳干品为材料提取DNA,不需芽孢分离和菌丝培养步骤,而且DNA产量高、质量好,可用于随机扩增多态性（random amplified polymorphic,RAPD）DNA分析。RAPD分析的结果显示,本实验所选取的银耳样品间存在DNA多态性。研究结果将有助于当前食品分析检测中直接以银耳干品为材料进行DNA提取及品种鉴别等分析工作。     

斑玉蕈菌株的IGS2序列和RAPD分析

采用转录单位间隔区2(IGS2)和随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析了斑玉蕈不同菌株的遗传差异。结果显示,20个不同斑玉蕈菌株的IGS2序列大小不一致,长度在1150~1203bp之间,序列相似度约在95%以上。在100个随机引物中筛选出11个能够扩增出稳定带型且菌株之间带型差异明显的RAPD引物,共扩增出142条条带,特异性条带134条,多态性比例较高,表明RAPD技术对斑玉蕈菌株的扩增具有丰富的多态性,能够在DNA水平上鉴别不同菌株是否存在差异。      

Identification of a triacylglycerol lipase gene family in Candida deformans: molecular cloning and functional expression

The yeast Candida deformans CBS 2071 produces an extracellular lipase which was shown to catalyse the production of various esters by the esterification of free fatty acids, even in the presence of a large molar excess of water. To clone the gene encoding this extracellular lipase, Saccharomyces cerevisiae was transformed with C. deformans genomic libraries and screened for lipolytic activity on a medium containing rapeseed oil emulsion and rhodamine B. Three members of a lipase gene family (CdLIP1, CdLIP2 and CdLIP3) were cloned and characterized. Each deduced lipase sequence has a Gly-His-Ser-Leu-Gly-(Gly/Ala)-Ala conserved motif, eight cysteine residues and encodes an N-terminal signal sequence. MALDI-TOF mass spectrometry analysis of a proteolytic digest of the lipase produced was used to obtain experimental evidence that the CdLIP1 gene encoded the extracellular lipase. Recombinant expression studies confirmed that the cloned genes encoded functional lipases. The three lipases are very similar to lipases from the related species Yarrowia lipolytica. Significant homologies were also found with several yeast and fungal lipases. As C. deformans CBS 2071 was previously considered to be synonymous with Y. lipolytica, the strains were compared for the extent of nucleotide divergence in the variable regions (D1/D2) at the 5'-end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA (rDNA) gene. This rDNA region has diverged sufficiently to suggest that C. deformans is a separate species. The nucleotide sequences of the CdLIP1, CdLIP2 and CdLIP3 genes will appear in the EMBL nucleotide sequence database under Accession Nos AJ428393, AJ428394 and AJ428395, respectively.     

Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Fermented Red Dragon Fruit Juices

Abstract: Red dragon fruit or red pitaya is rich in potassium, fiber, and antioxidants. Its nutritional properties and unique flesh color have made it an attractive raw material of various types of food products and beverages including fermented beverages or enzyme drinks. In this study, phenotypic and genotypic methods were used to confirm the identity of lactic acid bacteria (LAB) appeared in fermented red dragon fruit (Hylocereus polyrhizus) beverages. A total of 21 isolates of LAB were isolated and characterized. They belonged to the genus of Enterococcus based on their biochemical characteristics. The isolates can be clustered into two groups by using the randomly amplified polymorphic DNA method. Nucleotide sequencing and restriction fragment length polymorphism of the 16S rRNA region suggested that they were either Enterococcus faecalis or Enterococcus durans. Practical Application: Current research revealed the use of biochemical analyses and molecular approaches to identify the microbial population particularly lactic acid bacteria from fermented red dragon fruit juices.     

婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析

本研究旨在分析婴儿粪便长双歧杆菌的多样性,采用改良MRS培养基从哈尔滨地区健康婴儿粪便中分离双歧杆菌,采用生理生化实验结合16S rDNA和热应激蛋白60基因(heat-shock protein 60,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌多态性。实验从11个婴儿体内分离得到18株厌氧的细菌菌株,经形态学分析、生理生化实验、16S rDNA测序及hsp60测序实验发现,其中7株为长双歧杆菌长亚种,3株为长双歧杆菌婴儿亚种。RAPD和MLST结果表明:7株长双歧杆菌长亚种为6个基因型,3株长双歧杆菌婴儿亚种为2个基因型,上述结果说明不同人源婴儿粪便长双歧杆菌基因型差异较大。     

The phenotypic and genotypic characterization of Enterobacter sakazakii strains from infant formula milk

Enterobacter sakazakii is an emerging foodborne pathogen associated with severe diseases in neonates. Infant formula milk (IFM) has been identified as one of the major contaminated sources and a transmission vehicle. To determine the phenotypic and genotypic characterization of this pathogen, 22 E. sakazakii strains isolated from IFM by an FDA-recommended method and PCR on the α-glucosidase gene were subtyped by random amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR, enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR, and antibiotic resistance patterns. At a similarity threshold of 80%, 16 ERIC-PCR fingerprint types were identified with a discriminatory power (D) of 0.933, and 18 RAPD-PCR types were identified with D of 0.973. Resistance to 9 antibiotics tested by disk diffusion assay revealed 6 antibiotic resistance patterns with D of 0.749. The comparison of characterization indicated that RAPD-PCR and ERIC-PCR have high discriminatory power showing genetic diversity of E. sakazakii isolates, and ERIC-PCR patterns showed a closer correlation than RAPD-PCR patterns to phenotypic characterization and the brands of IFM. Overall, the ERIC-PCR typing method could be used for tracing sources of E. sakazakii isolates in the food chain.     

浓香型白酒酒醅可培养真菌的分离、鉴定及系统发育分析

对四川浓香型白酒酒醅可培养真菌进行分离、鉴定,并做系统发育分析。运用ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列可将部分菌株鉴定到种的水平,可培养丝状真菌优势菌为曲霉属(Aspergillus sp.)、红曲霉属(Monascus sp.)、根霉(Rhizopus sp.)。26S rRNA D1/D2序列可将所有分离酵母鉴定到种的水平,可培养酵母优势菌为假丝酵母属(Candida sp.)和毕赤酵母属(Pichia sp.)。