食源性致病菌焦磷酸通用引物测序方法的建立

建立一种利用焦磷酸测序技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella)的方法。通过对4种菌16SrRNA的保守序列可变区的同源性分析,设计出一套适合焦磷酸测序的扩增引物和测序引物,通过可变区位点差异,利用一套通用引物同时鉴别4种食源性致病菌,测序结果与数据库比对判断细菌种属。结果表明:建立的检测方法可在4 h内完成对4种菌的鉴定,测序鉴定结果与国标的传统生化方法完全一致,焦磷酸测序技术可用于食源性致病菌的检测和鉴定。     

应用焦磷酸测序技术快速检测食品中沙门氏菌

设计出适合特异性扩增引物和测序引物,采取焦磷酸测序技术对沙门氏菌invA毒力靶基因特异性序列分析,同时对焦磷酸测序反应条件进行优化,建立1种利用焦磷酸测序技术检测和鉴定沙门氏菌的方法。结果显示,此方法以传统国标法的前增菌为前提,可省去后期生化验证的繁琐过程,将检测时间由常规检测的4～7d缩短至20h,并且其准确性与传统生化验证完全一致。所建立的针对沙门氏菌的焦磷酸测序检测方法具有高效性、精准及操作简便等特点,适用于食品中沙门氏菌的快速检测。     

PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌研究

目的 建立结合PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法.方法 根据单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因设计扩增引物和测序引物,特异地扩增目的片段,再制备单链模板,在测序引物引导下进行焦磷酸测序,通过测序结果与GenBank中的hly基因序列的比对进行鉴定.结果 扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,16株单核细胞增生李斯特氏菌菌株均扩增出大小249 bp的DNA片段,焦磷酸测序结果与hly基因序列100％匹配,而阴性对照菌株均未扩增出DNA条带,焦磷酸测序结果为阴性.结论 建立的方法特异性高,是快速从DNA序列水平上检测单核细胞增生李斯特氏菌的有效手段.     

实时荧光定量PCR检测食品中常见食源性致病菌

建立一种快速、准确检测食品中常见食源性致病菌的方法。通过对食品样品提取基因组DNA和实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative)条件的优化,建立了沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌和副溶血弧菌这六种食源性致病菌的实时荧光定量PCR检测方法。通过食品样品的检测,同时进行了传统方法验证。研究建立的实时荧光定量PCR鉴定方法具有良好的重复性和准确性,能够2d出具检测报告,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品快速检测,具有很好的推广应用前景。     

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg²⁺浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在10² CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到10³ CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。     

多重 PCR 技术同时检测四种肠道致病菌方法的建立与初步应用

目的 建立同时检测4种食源性肠道致病菌的多重PCR方法。方法 分别依据沙门氏菌(Salmonella spp) 的fimA基因、弗氏枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii) 的ldh基因、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) 的idsC基因、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda) 的fimA基因设计4对特异性引物, 并对多重PCR反应条件进行优化。结果 建立的多重PCR方法具有结果可靠、灵敏度高、方便快捷的优点。结论 本研究为研发快速检测以上4种食源性肠道致病菌的试剂盒提供了重要技术保障。     

多重PCR技术同时检测四种肠道致病菌方法的建立与初步应用

目的建立同时检测4种食源性肠道致病菌的多重PCR方法。方法分别依据沙门氏菌(Salmonella spp)的fimA基因、弗氏枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii)的ldh基因、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的idsC基因、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)的fimA基因设计4对特异性引物,并对多重PCR反应条件进行优化。结果建立的多重PCR方法具有结果可靠、灵敏度高、方便快捷的优点。结论本研究为研发快速检测以上4种食源性肠道致病菌的试剂盒提供了重要技术保障。     

GeXP多重聚合酶链式反应法检测5种常见食源性致病菌

目的建立一种基于GeXP(GenomeLab~(TM) eXpress Profiling)遗传分析系统的5种常见食源性致病菌检测的新技术。方法针对5种常见食源性致病菌(沙门菌、大肠埃希菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、志贺菌和副溶血性弧菌)分别进行基因序列比对(invA、rfbE、PfrA、IpaH、tlh基因),设计特异性引物,建立并优化GeXP多重聚合酶链式反应(PCR)体系,评价其特异性和灵敏性,并初步应用于未知菌株和人工污染样品的检测。结果 GeXP多重PCR法可实现在5 h内同时对5种常见食源性致病菌进行检测,且检测灵敏度可低至10~3 CFU/mL。多重体系中各引物对各目标菌有较强特异性,未检出其他非目标菌。结论本方法可有效提高检测效率,为食源性致病菌的快速高通量检测提供了参考思路。     

十种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法

为建立能够同时检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌等10种食源性致病菌的多重PCR方法,通过特异性引物的设计、引物特异性验证、引物灵敏度验证和多重PCR检测体系主要反应条件优化,建立多重PCR检测体系,并对其特异性、灵敏度以及人工感染样品应用进行评价。结果表明,建立的多重PCR检测体系可以扩增出10种食源性致病菌的特异目标条带,无非特异扩增。测序结果与目的基因序列进行比对,其序列同源性高达98%,体系灵敏度可达10^-1 ng/μL。人工污染样品应用结果表明,采用多重PCR方法简单快速,仅需简单增菌,检出限可达10 CFU/mL,整个检测时间在48 h以内。建立的多重PCR检测体系特异性强、灵敏度较高,与检验机构实际检测工作联系紧密,具有推广应用价值。     

实时荧光等温扩增法检测4种常见食源性致病菌

目的建立实时荧光等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌4种常见食源性致病菌的分析方法。方法根据4种致病菌特异性基因合成LAMP引物,在反应前加入荧光染料,在63℃条件下反应45 min;反应结果可以根据扩增曲线变化直接判断。并通过在实际样品中添加标准菌株菌液,测定了其在增菌0、6、24 h的检测灵敏度。结果金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌等基因组DNA的LAMP检测灵敏度为1 pg,副溶血性弧菌的检测灵敏度为10 pg;在样品加标实验中,其灵敏度在6 h分别可达到101、100、100、102 CFU/mL。结论该方法用于食源性致病菌的快速检测,具有可实时监控反应过程、反应快速,灵敏度和特异性高等优点,适合于基层食品安全监管领域现场快速检测。     

Pathogenic bacteria in sewage treatment plants as revealed by 454 pyrosequencing

This study applied 454 high-throughput pyrosequencing to analyze potentially pathogenic bacteria in activated sludge from 14 municipal wastewater treatment plants (WWTPs) across four countries (China, U.S., Canada, and Singapore), plus the influent and effluent of one of the 14 WWTPs. A total of 370,870 16S rRNA gene sequences with average length of 207 bps were obtained and all of them were assigned to corresponding taxonomic ranks by using RDP classifier and MEGAN. It was found that the most abundant potentially pathogenic bacteria in the WWTPs were affiliated with the genera of Aeromonas and Clostridium. Aeromonas veronii, Aeromonas hydrophila, and Clostridium perfringens were species most similar to the potentially pathogenic bacteria found in this study. Some sequences highly similar (>99%) to Corynebacterium diphtheriae were found in the influent and activated sludge samples from a saline WWTP. Overall, the percentage of the sequences closely related (>99%) to known pathogenic bacteria sequences was about 0.16% of the total sequences. Additionally, a platform-independent Java application (BAND) was developed for graphical visualization of the data of microbial abundance generated by high-throughput pyrosequencing. The approach demonstrated in this study could examine most of the potentially pathogenic bacteria simultaneously instead of one-by-one detection by other methods.     

高分辨率溶解曲线检测9种食源性致病菌方法的建立

当今食源性疾病已成为一个全球关注的食品卫生问题,常见的细菌性食物中毒的病原菌有:致病性大肠杆菌(特别是出血性大肠杆菌O157:H7)、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性弧菌(包括霍乱弧菌和副溶血弧菌)、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌以及阪崎克罗诺杆菌等。单独检测一种致病菌已无法满足现今社会对同时高效检测多种致病菌的要求,为建立一种同时对上述9种食品中常见致病菌的检测方法,本研究分别以上述9种菌的特异性基因为靶基因,创新性地结合一对通用引物,建立能同时检测多种食源性致病菌的多重HRM-real time PCR检测体系。结果表明该多重HRM-real time PCR检测体系通过两管PCR反应可对上述9种食品中常见致病菌进行有效的检测与区分,且具有良好的特异性和灵敏度。     

基于叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应PMA-qPCR 结合与高温裂解法高通量测序技术检测鉴定检测冷链食品中5多种 病原菌并构建金黄色葡萄球菌分子进化树完成病原菌分子进化树构建与溯源分析

目的 将PMA-qPCR、高通量测序以及分子进化树构建技术相结合,应用于冷链食品中多种病原菌的快速检测、种属鉴定、亲缘关系确定与溯源分析工作。 建立冷链食品中多种病原菌的快速检测技术并完成金黄色葡萄球菌的溯源分子进化分析工作。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌等等5种病原菌5种病原菌为作为研究对象, 应用PMA-qPCRPMA-qPCR技术结合高温裂解法作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对验证qPCR结果,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。研发病原菌活菌快速检测方法并开展冷链食品中病原菌的抽样调查。在建立稳定高效的检测方法后,为了获得冷链食品中病原菌污染水平、分布数据以及污染来源,研究开展冷链食品中病原菌的抽样调查检测工作。在检测出金黄色葡萄球菌等并分离病原菌后,进一步通过多位点采样以及16S rRNA测序构建了葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子生物进化树,完成菌株种属鉴定采用构建分子进化树的方法以及完成金黄色葡萄球菌等病原菌的溯源分析工作。结果 本研究应用建立的PMA-qPCR成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰感染,病原菌最低检测浓度可达到1×103 CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在16小时内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,本研究共从随机采集的751份冷链食品中检出6162株病原菌,病原菌总体检出率为8.13% (6162/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。通过分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄菌的污染来源并完成菌种种属定位。本研究还注意到经微生物检验一株疑似单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌株,该菌株后续通过测序、序列比对以及分子进化树构建确定为英诺克李斯特菌,这充分说明高通量测序的重要性以及方法验证的必要性。结论 研究在国内率先将PMA-qPCR、高通量测序与分子进化树构建技术相结合,应用于应用本研究方法可以快速有效检测5种冷链食品中的冷链食品中多种病原菌检测分析与种属鉴定,并完成金黄色葡萄球菌的溯源分析,方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,研究方法与成果可以为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供全新的思路与方法。     

利用高通量测序分析云南豆豉中细菌群落多样性

发酵食品是人类饮食的重要组成之一,其中豆豉风味独特,富含多种生理活性物质。微生物在食品发酵过程中起着极为重要的作用。作者选择云南豆豉为研究对象,使用焦磷酸高通量测序,可以全面地分析豆豉中的细菌群落,能够得到其中稀少群落(rare biosphere)的信息。乳酸杆菌是丰度最高的细菌,占总序列数的72%,在豆豉发酵中起重要作用;芽孢杆菌也是重要的细菌,占序列总数的10%。此外,还发现了属于人类致病菌(Shigella flexneri)和植物病原菌(Erwinia persicina)的序列,显示出传统方法制作的豆豉中存在着食品安全隐患。     

利用选择性培养基快速初步鉴定食品中的致病微生物

目的 建立快速区分鉴别某种(类)微生物的方法。方法 选择几种常用的培养基, 将不同的菌株接种在培养基上, 通过培养基成分对不同微生物的选择性、显色反应及不同菌株在选择性培养基上具有的特征性菌落形态, 初步并快速判定微生物, 尤其是致病类微生物。结果 大肠埃希氏菌会与其他致病菌混淆, 可以通过结晶紫中性红胆盐(crystal violet neutral red bile salt, VRBA)琼脂将其区分; 志贺氏菌在培养基上菌落基本均为半透明, 体现的均为培养基本身的颜色; 亚硫酸铋(sulfurous acid bismuth, BS)琼脂的选择性较强, 但鼠伤寒沙门氏菌在该培养基上长势良好。结论 该方法可有效提高鉴别致病菌的效率。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病基因方法的建立

建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

The fate of indigenous microbiota, starter cultures, Escherichia coli, Listeria innocua and Staphylococcus aureus in Danish raw milk and cheeses determined by pyrosequencing and quantitative real time (qRT)-PCR

The purpose of this work was to study the bacterial communities in raw milk and in Danish raw milk cheeses using pyrosequencing of tagged amplicons of the V3 and V4 regions of the 16S rDNA and cDNA. Furthermore, the effects of acidification and ripening starter cultures, cooking temperatures and rate of acidification on survival of added Escherichia coli, Listeria innocua and Staphylococcus aureus in cheeses at different stages of ripening were studied by pyrosequencing and quantitative real time (qRT)-PCR. A high diversity of bacterial species was detected in raw milk. Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus were the main bacteria detected in raw milk and cheeses. Bacteria belonging to the genera Brevibacterium, Staphylococcus, Escherichia, Weissella, Leuconostoc, Pediococcus were also detected in both 16S rDNA and cDNA obtained from raw milk and cheeses. E. coli, which was added to milk used for production of some cheeses, was detected in both DNA and RNA extracted from cheeses at different stages of ripening showing the highest percentage of the total sequence reads at 7 days of ripening and decreased again in the later ripening stages. Growth of E. coli in cheeses appeared to be affected by the cooking temperature and the rate of acidification but not by the ripening starter cultures applied or the indigenous microbiota of raw milk. Growth of L. innocua and S. aureus added to milks was inhibited in all cheeses at different stages of ripening. The use of 16S rRNA gene pyrosequencing and qRT-PCR allows a deeper understanding of the behavior of indigenous microbiota, starter cultures and pathogenic bacteria in raw milk and cheeses.     

二重LAMP检测鸡蛋污染致病菌

为快速检测污染鸡蛋的致病菌,实验从鸡蛋蛋体表面得到2株菌X1、X2,结合16S r RNA克隆及质粒测序分子方法对2株菌分类分析,发现2株菌X1和X2分别为:蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401(AP007209)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(AP003088)。针对两种菌的nhe、nuc基因具有较强的保守性,设计2套环介导等温扩增(LAMP)引物。先进行反应体系优化,得到25μL LAMP反应体系最适温度为60℃、最适Mg SO4添加量为1.5μL,引物最适量为2.0μL。再进行二重LAMP鉴定2株污染鸡蛋的致病菌,发现目的菌X1和X2的特异性扩增结果为阳性,其他9株非目的菌扩增结果为阴性,其灵敏度检测限达10 fg/μL。此二重LAMP检测法有快速、特异、灵敏的特点,可快速检测食源性致病菌。      

Rapid detection of Listeria monocytogenes using fluorescence immunochromatographic assay combined with immunomagnetic separation technique

To ensure the safety and quality of food ingredients, especially meat and dairy products, a high‐throughput, rapid and sensitive method to detect Listeria monocytogenes (LM) is always on a high demand. In this work, a specific induction method to enrich and detect LM based on fluorescence immunochromatographic assay (FICA) combined with immunomagnetic separation (IMS) techniques has been developed. The immunomagnetic‐beads (IM) beads were obtained through functionalised magnetic microspheres and the conjugated reaction between the carboxyl on beads surface and amino groups of antibody. The prepared IM‐beads could be used for rapidly enriching pathogenic bacteria with fewer steps, resulting in a high specificity for four pathogenic serotypes and about a 40‐fold improvement of detection limit compared with FICA only. In addition, this method was successfully applied in LM detection in sausage, pork and milk samples with a potential for further application in rapid on‐site detection of pathogenic bacteria.     

免疫层析技术在食源性病原菌检测中的应用展望

免疫层析技术是一种建立在层析技术和抗原抗体特异性免疫反应基础上的免疫检测技术。近年来国内外食源性疾病频繁爆发,越来越引起社会的关注。因此建立一种快速、简便且适用于食源性病原菌的检测方法在预防和诊断食源性疾病中具有重大的社会意义。免疫层析技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便及检测速度快等特点,已经被广泛应用于食品领域的检测中。本文综述了6种免疫标记材料在检测不同种类病原菌方面的应用,并对其检测特点进行了介绍。