重组人白细胞介素-1受体拮抗剂质量控制研究

目的建立重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的质控方法和标准。方法采用黑色素瘤A375.S2细胞杀伤中和试验测定rhIL-1ra的生物学活性,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的质控方法对rhIL-1ra原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论建立的质控方法和标准可保证产品安全有效,可用于rhIL-1ra的检定。     

重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究

本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0 %左右     

细菌内同源重组构建人p21~(WAF1)基因重组腺病毒

目的构建人p21WAF1基因重组腺病毒载体,并在293细胞中包装制备重组腺病毒。方法将人p21WAF1基因亚克隆连接到腺病毒转移质粒pshuttle-cmv,得到阳性重组转移质粒psh-p21。先将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转化BJ5183菌,筛选得到AdBJ5183菌,再将PmeⅠ线性化的psh-p21转化AdBJ5183菌,经细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdp21。经PacⅠ和BstXⅠ酶切及PCR鉴定,将正确的重组腺病毒质粒pAdp21转染293细胞包装病毒,用RT-PCR和PCR鉴定重组腺病毒及其稳定性。结果所构建的重组腺病毒质粒pAdp21,经PCR鉴定,可扩增出约500bp的片段,与预期大小相符。转染293细胞可包装成p21WAF1基因重组腺病毒,经电镜观察,具有典型的腺病毒特征。结论已成功地构建了重组腺病毒质粒pAdp21,并制备出重组腺病毒rAdp21。     

重组人白细胞介素-2注射液

北京四环生物制药有限公司研制的重组人白细胞介素-2注射液获得国家新药证书，同时公司研制的规格为50万IU／瓶、100万IU／瓶的重组人白细胞介素-2注射液获得生产批文。重组人白细胞介素-2注射液是该类产品的新剂型，为国内独家首创，也是国际上目前惟一水针剂型产品．市场前景极为广阔。     

人白细胞介素-2单克隆抗体的研究

应用杂交瘤技术获得6株抗人白细胞介素-2单克隆抗体细胞株，并对其特性进行分析，各单抗滴度不一，有的高达10(16)，有的则在1∶10左右，大多数（5种）为IgG型，少数（1种）为IgM型。单克隆抗体与纯化的IL－2有明显的特异性吸附（P＜0．01）。有4种单克隆抗体有相同的吸附位点，另外2种至少有3个吸附位点，位阻表现不一。     

重组人白细胞介素-10的表达与纯化

目的表达并纯化重组人白细胞介素-10蛋白,并进行活性检测。方法将重组质粒PCRT7/NT-TOPO-IL-10转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,IPTG诱导表达。采用Ni柱对表达产物进行亲和纯化,并检测其对外周血单核细胞分泌TNF-α的影响。结果IPTG诱导4h,目的蛋白表达量最高,可达45.02%,主要以包涵体形式表达。纯化后,所得目的产物的回收率为66.72%,纯度约为80.42%。纯化的IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α具有抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组IL-10蛋白。     

重组人白细胞介素-31表达条件的优化

目的优化重组人白细胞介素-31(rhIL-31)的表达条件。方法以不同浓度IPTG、不同诱导时间、不同诱导温度对含有pET32a/rhIL-31的工程菌E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果诱导时间为5h,IPTG浓度为1.5mmol/L,诱导温度为37℃时,rhIL-31的表达量最高。结论已初步优化了重组蛋白rhIL-31的表达条件。     

小鼠白细胞介素-17及其shRNA重组表达质粒的构建

目的构建小鼠白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及其shRNA重组表达质粒。方法以小鼠脾脏细胞总RNA为模板,PCR扩增IL-17基因,并亚克隆至质粒pLVX-IRES-ZsGreen1,构建重组表达质粒pLVX-IL-17-IRESZsGreen1;设计并合成3对针对IL-17基因的shRNA序列和1对阴性对照shRNA序列,分别插入质粒pLVX-shRNA,构建重组干扰质粒pLVX-shRNA1、pLVX-shRNA2、pLVX-shRNA3和阴性对照质粒shRNAC,进行测序;用脂质体法将各重组干扰质粒分别与表达质粒共转染293T细胞,分为空白对照组、过表达组、shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组和shRNAC组,经荧光定量PCR和ELISA法分别检测各组细胞中IL-17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果 PCR扩增获得500 bp的目的基因,IL-17重组表达质粒及其shRNA重组质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;重组表达质粒转染293T细胞48 h后可见绿色荧光表达;过表达组IL-17基因mRNA及蛋白表达水平均明显高于空白对照组(P均<0.05),shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组IL-17基因mRNA和蛋白表达水平均明显低于shRNAC组(P均<0.05)。结论成功构建了小鼠IL-17基因重组表达质粒及其特异性shRNA表达质粒,并筛选出shRNA1,其对IL-17的表达具有最佳的抑制效应。     

人白细胞介素-29的生物信息学分析

目的利用生物信息学技术对人白细胞介素-29(Human nterleukin-29,IL-29)进行分析,为定点突变hIL-29,以提高其生物学活性奠定理论基础。方法利用生物信息学技术分析克隆得到的hIL-29基因,预测hIL-29基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及可能影响其生物学活性的关键氨基酸位点;预测其三维结构,并与IFNλ3的晶体结构进行比对;对检索到的9个物种的IL-29基因同源序列进行比对,并构建系统进化树。结果 hIL-29基因编码蛋白含200个氨基酸残基,其N-末端19个氨基酸为信号肽,成熟肽的相对分子质量为20 018,理论等电点为9.08,肽链中含一个由胞内向胞外的跨膜结构域;hIL-29的空间构象由6个α螺旋(A～F)和无规则卷曲组成,螺旋A、B和F可能是hIL-29与特异性受体结合而发挥生物学效应的活性部位,A、F螺旋中有4个氨基酸残基可能是影响其生物学活性的关键氨基酸位点;系统进化分析显示,hIL-29与狗、猫、大熊猫、马、野猪、黑猩猩、长臂猿的IL-29具有较高的同源性,处于同一个大分枝,而人、黑猩猩、长臂猿的IL-29处于同一个小分枝,在系统进化树中的距离最近。结论关键位点氨基酸的差异可能对hIL-29的生物学活性影响较大,可作为对hIL-29进行分子改造的突变位点。本研究为后续进行hIL-29的定向改构及其构效关系等的深入研究奠定了理论基础。     

人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12共表达质粒的构建与真核表达

目的构建能分泌表达相对分子质量为9000的人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核共表达质粒,并检测其蛋白表达。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9000的颗粒溶素活性肽基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。同时,将小鼠IL-12亚克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12。采用RT-PCR、免疫细胞化学与Dot-ELISA法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌。ELISA检测mIL-12的表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;Dot-ELISA检测表明颗粒溶素可分泌到细胞外。ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达。结论已成功构建真核表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,并能体外表达,为下一步利用颗粒溶素与mIL-12基因治疗肿瘤奠定了基础。     

人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装

目的构建携带有人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中进行包装。方法将gB基因克隆至穿梭质粒Track-CMV,构建重组质粒Track-CMV/gB,亚克隆至转移载体pAD-Easy-1,构建重组质粒pAD-Easy-1/gB,将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用HEK293细胞产生重组腺病毒。空斑法及PCR法挑选重组病毒,荧光显微镜观察标志蛋白(绿色荧光蛋白)的表达,利用噬斑法检测病毒滴度。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,转染重组腺病毒载体的HEK293细胞经PCR扩增,可见约700bp的目的基因片段,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,空斑试验检测病毒滴度为2×106PFU/ml。结论已成功构建了含有gB基因的重组腺病毒载体,为进一步研制重组腺病毒载体HCMV疫苗提供了条件。     

携带人6Ckine/IFNγ融合基因腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带人次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)和γ-干扰素(IFNγ)融合基因的重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达。方法RT-PCR法分别从人淋巴结和外周血单个核细胞中扩增人6Ckine cDNA和IFNγ cDNA,分两步先后将6Ckine cDNA和IFNγ cDNA连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,二者之间以XbaⅠ酶切位点相连,应用AdMax腺病毒包装系统在HEK293细胞内同源重组,构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,经扩增和纯化后感染真核细胞HepG2,并检测6Ckine/IFNγ融合蛋白的表达。结果所构建的重组腺病毒Ad-6Ckine/IFNγ经扩增和纯化后,滴度为1.26×1010IFU/ml。PCR法鉴定无野生型腺病毒的污染,所携带的6Ckine/IFNγ融合基因能在真核细胞中得到表达,表达形式为分泌型。结论已成功构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达,为进一步研究肿瘤的基因和免疫治疗奠定了基础。     

The Anti-Atherosclerosis Effect of Anakinra,a Recombinant Human Interleukin-1 Receptor Antagonist,in Apolipoprotein E Knockout Mice

Interleukin (IL)-1β plays an important role in atherosclerosis pathogenesis. We aimed to investigate the effect of anakinra, a recombinant human IL-1 receptor antagonist, on the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout (ApoE^–/–) mice. ApoE^–/– mice (8-week male) were treated with saline (control), anakinra 10, 25, and 50 mg/kg, respectively (n = 10 in each group). Mice were fed a standard chow (4 weeks) followed by an atherogenic diet (35kcal% fat, 1.25% cholesterol, 12 weeks). Atheromatous plaques in ApoE^–/– mice and the expression of inflammatory genes and signaling pathways in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), rat aortic smooth muscle cells (RAOSMCs), and 3T3-L1 adipocytes were assessed. Anakinra reduced the plaque size of the aortic arch (30.6% and 25.2% at the 25 mg/kg and 50 mg/kg doses, both p < 0.05) and serum triglyceride in ApoE^–/– mice and suppressed inflammatory genes (IL-1β and IL-6) expressions in HUVECs and RAOSMCs (all p < 0.05). In RAOSMCs, anakinra reduced metalloproteinase-9 expression in a dose-dependent manner and inhibited cell migration. Anakinra-treated mice exhibited trends of lower CD68+ macrophage infiltration in visceral fat and monocyte chemoattractant protein-1 expression was reduced in 3T3-L1 adipocytes. Anakinra could be a useful component for complementary treatment with a standard regimen to reduce the residual cardiovascular risk.     

含IL-2基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫效果

目的构建含白细胞介素-2(IL-2)基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗,并考察免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site,IRES)基因克隆到质粒pVAX1载体多克隆位点处,再将乙肝病毒表面抗原(HB-sAg)基因和IL-2基因分别连接在IRES基因的两侧,构建出乙肝病毒DNA疫苗pHII。将pHII转染COS-7细胞,进行瞬时表达。大量提取质粒后,按0、2、4周程序免疫BALB/c小鼠,以pVAX1质粒为阴性对照,pVAX/HBsAg质粒为阳性对照。第1针免疫1周后开始眼眶采血,检测血清中HBsAg和HBsAb含量。第1针免疫13周后处死小鼠,用流式细胞仪检测其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子数量。结果在转染pHII质粒的COS-7细胞上清液中检测到HBsAg和IL-2的表达。实验组和阳性对照组小鼠分别于第1针免疫2、4周后,在血清中检测出HBsAb,但阴性对照组未测出。以上3组均未检测出HBsAg。实验组与阳性对照组相比,产生抗体的时间提前2周,抗体阳转率提高2.5倍,产生抗体的量也提高了近3倍。实验组CD4+分子数量和CD4+/CD8+值均高于阳性对照组。结论乙肝病毒DNA疫苗pHII成功诱导出小鼠的免疫应答,其免疫效果明显优于不含分子佐剂的乙肝DNA疫苗。     

Interleukin-1 Receptor Antagonist Reduces Neonatal Lipopolysaccharide-Induced Long-Lasting Neurobehavioral Deficits and Dopaminergic Neuronal Injury in Adult Rats

Our previous study showed that a single lipopolysaccharide (LPS) treatment to neonatal rats could induce a long-lasting neuroinflammatory response and dopaminergic system injury late in life. This is evidenced by a sustained activation of microglia and elevated interleukin-1β (IL-1β) levels, as well as reduced tyrosine hydroxylase (TH) expression in the substantia nigra (SN) of P70 rat brain. The object of the current study was to test whether co-administration of IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) protects against LPS-induced neurological dysfunction later in life. LPS (1 mg/kg) with or without IL-1ra (0.1 mg/kg), or sterile saline was injected intracerebrally into postnatal day 5 (P5) Sprague-Dawley male rat pups. Motor behavioral tests were carried out from P7 to P70 with subsequent examination of brain injury. Our results showed that neonatal administration of IL-1ra significantly attenuated LPS-induced motor behavioral deficits, loss of TH immunoreactive neurons, as well as microglia activation in the SN of P70 rats. These data suggest that IL-1β may play a pivotal role in mediating a chronic neuroinflammation status by a single LPS exposure in early postnatal life, and blockading IL-1β might be a novel approach to protect the dopaminergic system against perinatal infection/inflammation exposure.     

应用AdMax系统构建携带HCV核心基因Core的重组腺病毒载体

目的应用AdMax系统构建携带丙型肝炎病毒(HCV)核心基因Core的重组腺病毒载体,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础。方法RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增HCVCore基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core,经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度,并计算比活性及单细胞产量。结果重组腺病毒pAd-Core感染的HEK293细胞经PCR检测,可扩增出HCV核心基因Core片段,经测序证明,其插入序列与设计的HCV Core基因序列一致。扩增纯化后,重组腺病毒的比活性达0.034IU/VP,单细胞产量可达2.63×104VP/细胞。结论已成功构建重组腺病毒载体pAd-Core,为Core基因在腺病毒介导下的基因免疫和基因治疗的研究奠定了基础。     

大鼠活化STAT蛋白抑制剂1基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠活化STAT蛋白抑制剂1(Protein inhibitor of activated STAT1,PIAS1)基因重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法应用RT-PCR法从大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞株中扩增全长PIAS1基因,经T-A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pDC316中,利用同源重组将腺病毒骨架质粒Nad5/F35和穿梭质粒pDC316-PIAS1共转染293细胞,获得重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1,经包装和扩增后,获得重组腺病毒。RT-PCR检测PIAS1基因的表达;荧光显微镜观察病毒感染情况;Western blot检测PIAS1蛋白的表达;并计算重组腺病毒的滴度。结果从AR42J细胞中扩增出1 956 bp的PIAS1基因片段,重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1经双酶切鉴定证明构建正确。RT-PCR及Western blot分析显示,PIAS1基因和蛋白已在293细胞中表达;荧光显微镜观察显示,重组腺病毒的感染率达90%;病毒滴度为4.45×1010 PFU/ml。结论已成功构建了大鼠PIAS1基因重组腺病毒质粒,为进一步研究PIAS1基因在相关疾病中的作用及其临床应用奠定了基础。     

Kozak序列引导的人p53基因重组智能腺病毒载体的构建与表达

目的构建Kozak序列引导的人p53(khp53)基因重组智能腺病毒载体rAdMH-khp53,并检测p53基因的表达。方法将带有Kozak序列的p53基因克隆到重组腺病毒穿梭载体中,再利用AdMaxTMHi-IQ系统,获得重组腺病毒,检测病毒滴度,并进一步感染Saos-2细胞,利用RT-PCR及Western blot检测p53基因的表达。结果khp53基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.63×108IU/ml,RT-PCR方法检测到p53基因的转录产物,Western blot检测到p53基因在Saos-2细胞中的高水平表达。结论已成功构建了带有Kozak序列的重组腺病毒载体rAdMH-khp53,并高效表达人p53基因。