短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达

按常规分子克隆方法将马铃薯中高表达的ｐａｔａｔｉｎ启动子和乙肝表面抗原基因分别插入双元质粒ｐＢＩ１０１成为植物表达载体ｐＰＨＧ９,由前者驱动后者表达;通过农杆菌转化法将乙肝表面抗原基因导入马铃薯并获得再生植株;用ＥＬＩＳＡ方法检测经ＰＣＲ鉴定的转基因植株中乙肝表面抗原的含量,对照标准曲线得知转基因马铃薯植株中的乙肝表面朱含量高达１００￣１７４ｎｇ／ｍｇ可溶性蛋白。     

来源于芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子选择偏好对来源于芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶基因lacO进行了分子改造.改造后的基因lacM按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上,构建得到重组毕赤酵母表达质粒.PCR检测、SDS-PAGE电泳分析和酶活力测定的结果表明,lacM基因已重组到酵母染色体上,并能正常分泌表达.与未改造的基因lacO的毕赤酵母重组子相比,酶蛋白表达量明显增加,约为改造前的3倍以上.     

枯草芽孢杆菌植酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其对酶热稳定性的影响

采用PCR法,获得不含有信号肽序列的来源于枯草芽孢杆菌的植酸酶phyC基因的非融合和融合表达片段,分别构建带有T7lac启动子的大肠杆菌的植酸酶pET30NFphyC和pET30FphyC表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)。大肠杆菌分别在30℃和25℃经IPTG诱导后实现了植酸酶的表达,非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的13％和15％,分子量分别为40．13kDa和43．27kDa。表达产物具有植酸酶的生物学活性,非融合植酸酶和融合植酸酶的最适反应温度分别为50℃和75℃,经90℃处理10min,残留酶活性分别为37℃时的31．9％和75．7％。分析表明,含13个氨基酸残基的融合片段有助于植酸酶的表达和酶热稳定性的提高。     

sbeIIb基因hpRNA结构植物转化载体的构建

hpRNA介导基因沉默技术是一种下调某个内源目的基因表达的有效技术.本研究将淀粉分支酶基因sbeIIb启动子控制下的sbeIIb基因的hpRNA结构构建于植物双元表达载体pCAMBIA1305.1中,并将该重组载体导入农杆菌超毒力菌株AGL1中,构建了一种适于禾本科的植物转化载体.     

苏云金芽孢杆菌cry3Aa启动子的克隆和营养期表达载体的构建

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)的绝大多数杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs)基因是在芽孢形成期（sporulation phase)表达的,而只有少数基因如cry3Aa是在营养期表达的。在本研究中,根据已知的cry3Aa基因启动子序列设计了一对引物（Ep-5s和Ep-3n),利用这对引物从拟步虫甲亚种（Bt subsp.tenebrions)中扩增出一个与预期大小（1．1kb)一致的DNA片段。序列测定及分析结果表明,这个DNA片段含cry3Aa启动子全序列,包括上游AT富含区、两个启动子区、两个SD序列及两组反向重复序列。经过一系列的克隆之后将这个片段克隆到穿梭载体pHT3101上,最后构建成一个Bt的营养期表达载体pHPT。     

豌豆铁蛋白基因植物转化载体的构建

实验将 Ca MV35 S启动子控制下的铁蛋白基因构建于植物双元表达载体 p Cambia 130 1中 ,并将该重组载体导入农杆菌超毒力菌株 EHA10 5 ,以建立适合于禾本科的植物转化系统 ,为铁蛋白基因的转基因及其功能研究奠定基础     

一种新型双向启动子--棉花曲叶病毒启动子的分离、序列分析与功能初探

以棉花曲叶病毒(CLCuV)侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增CLCuV双向启动子片段并插入克隆载体.序列分析和同源性比较表明,克隆的启动子长436bp,与目前发现的9种CLCuV株系的启动子序列均不相同,同源性最高达99.32%.将启动子片段分别以不同方向与GUS报告基因和nos终止子融合,构建了瞬时表达载体.通过基因枪法将质粒载体导入烟草和棉花叶片细胞中进行瞬时表达,结果表明,互补链基因方向启动子属强启动子,在叶肉及维管组织均有较高的活性;病毒链基因方向启动子表达活性较低.本文初步证实分离的互补链基因启动子可作为新型强启动子应用于双子叶植物尤其棉花的遗传转化.     

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)G63.运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因(lipA)及其伴侣基因(lipB).该脂肪酶基因开放式阅读框(ORF)为1092bp,编码364个氨基酸残基.经KpnⅠ/HindⅢ酶切,将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上,构建成质粒pBBR1-lipAB.通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,转入原宿主菌P.cepacia G63中,构建成lipA基因同源高效表达的基因工程菌.该菌株在连续转接5次,培养45h后质粒保持率为82.6%,适用于规模化发酵生产.摇床发酵表明,工程菌在60h时酶活达到150.63 U/mL,较原始菌株提高3.6倍.     

WSSV-VAP1基因克隆及在毕赤酵母中的表达

根据WSSV-黏附蛋白(VAP1)基因序列设计了一对引物,在5‘引物和3‘引物中分别引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增,将VAP1基因克隆至穿梭载体pGAPZαA之GAP启动子下游位点,构建成含α-factor信号肽的重组表达载体,获得的重组质粒pGAPZαA-VAP1经线性化后转入毕赤氏酵母SMD1168菌株,构建成分泌型表达VAP1的酵母工程菌株。SDS-PAGE和Western-blot及结合活性检测分析表明,VAP1基因在该体系中得到成功表达,表达产物与对虾细胞膜具明显的结合活性。