浓香型白酒酿造用窖泥微生物群落研究

<正>浓香型白酒窖泥中栖息着大量可培养及不可培养的微生物,而这些微生物群落组成及多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。全面剖析窖泥中功能微生物菌群组成及多样性、窖泥质量与微生物群落之间的关联性为深入认识浓香型白酒生产机制,从根本上提升浓香型白酒品质提供理     

浓香型白酒窖泥微生物群落多样性及理化因素对其影响

采用Illumina Miseq高通量测序技术解析豫酒某浓香型酒企4年和40年窖池的窖壁、窖底泥原核微生物群落多样性和组成。结果表明,窖泥样品操作分类单元（operational taxonomic units,OTU）数量、Chao1指数和ACE指数没有显著性（P＞0.05）差异,40年窖底泥香农（Shannon）指数和辛普森（Simpson）指数显著性（P＜0.05）偏低。窖泥优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、广古菌门（Euryarchaeota）和放线菌门（Actinobacteria）;优势菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、产己酸菌属（Caproiciproducens）、不动菌属（Acinetobacter）、理研菌属（Petrimonas）等共12个菌属,隶属于4个门,且集中在厚壁菌门（Firmicutes）。厚壁菌门（Firmicutes）在40年窖底泥中占绝对优势,Bacteroidetes和Euryarchaeota在4年窖底泥和40年窖壁泥中含量都较高;Lactobacillus为40年窖壁、窖底泥第一大优势菌属,而4年窖壁泥和窖底泥第一优势菌属分别为Acinetobacter和Caproiciproducens。冗余分析（redundancy analysis,RDA）显示,总酸（30.7%）和pH值（15.7%）与窖泥优势菌群的相关性最高且显著（P＜0.05）,说明总酸和pH值可能是影响上述不同类型窖泥优势菌群空间分布的主要理化因子。     

浓香型白酒窖池中细菌群落结构的研究

为探究浓香型白酒窖池中细菌群落结构和多样性变化，采用HiSeq高通量测序技术，对6个窖池样品中的细菌16S rRNA基因V3～V4区进行测序分析，比较了窖泥和酒醅中的细菌物种组成和丰度，解析了窖泥和酒醅中共有的细菌物种和关键差异物种，探究了浓香型白酒窖池中潜在的关键细菌菌种。研究结果表明，3个窖泥样品共注释到1 009个OTUs,主要分布于厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidete),其中厚壁菌门菌株的丰度超过了60%;3个酒醅样品共注释518个OTUs,主要分布于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。窖泥样品中的细菌物种总数和多样性均高于酒醅样品，窖泥样品中关键的细菌菌种主要来自梭菌属(Clostridium IV)、岩石单胞菌属(Petrimonas)、沉积物棒菌属(Sedimentibacter)、嗜蛋白菌属(Proteiniphilum)和喜热菌属(Caloramator);酒醅样品中关键的细菌菌种主要来自乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propioni...     

退化和正常窖泥微生物多样性的比较分析

浓香型白酒窖泥微生物多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。本研究采用Miseq高通量测序技术对退化窖泥(n=5)和正常窖泥样品(n=5)细菌多样性进行了比较分析,结果发现退化窖泥微生物群落的超1和香农指数均显著高于正常窖泥(p<0.05)。退化窖泥中Clostridium(梭菌)、Syntrophaceticus、Syntrophomonas(互营单胞菌属)、Petrimonas、Sedimentibacter(沉淀杆菌属)、Aminobacterium(胺小杆菌属)、Lysinibacillus(梭形杆菌属)和Pelotomaculum的相对含量显著高于正常窖泥(p<0.05),而Lactobacillus(乳酸杆菌)、Bacillus(芽孢杆菌)、Ralstonia(雷尔氏菌属)和Nocardia(诺卡氏菌属)呈现出相反的趋势(p<0.05)。基于UniFrac距离的主坐标分析和聚类分析均表明,2类窖泥细菌群落结构存在较大差异。通过冗余分析发现9个OTU代表了2类窖泥微生物群落结构差异显著相关的关键细菌类群,其中4个隶属于Lactobacillus(乳酸杆菌)的OTU在正常窖泥中含量比较高,5个分别隶属于Clostridium(梭菌)、Syntrophomonas(互营单胞菌属)、Pelotomaculum和Synergistaceae(互养菌科)的OTU在退化窖泥中含量比较高。本研究对揭示细菌多样性和窖泥质量间的关联性可能具有一定积极意义。     

酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中真菌多样性分析

该研究应用Illumina MiSeq高通量测序技术解析酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中真菌多样性,并阐明其优势真菌群落结构及其随酿造工艺动态变化。结果表明,在酒曲中主要优势菌有曲霉属（Aspergillus）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）;堆积发酵酒醅中主要优势菌有拟青霉属（Paecilomyces）、念珠菌属（Candida）;窖内发酵酒醅中主要优势菌有嗜热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热真菌属（Thermomyces）;窖泥中主要优势菌有假霉样真菌属（Pseudallescheria）、镰刀菌属（Fusarium）。同一酒厂和不同酒厂新老车间酒曲、堆积发酵、窖内发酵、窖泥之间真菌组成相似度较高,但其优势菌群丰度差异显著。发酵车间使用年限及窖龄影响着酿酒微生物多样性;使用时间长的车间和窖池其环境微生物种群结构更稳定,优势菌群更突出。     

酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中细菌多样性分析

该研究应用Illumina MiSeq高通量测序技术解析酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中细菌多样性,并阐明其优势真菌微生物群落结构及其随酿造工艺动态变化。结果表明,在酒曲中主要优势菌有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）;堆积发酵中主要优势菌有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、变形菌纲（Proteobacteria）;在窖内发酵中乳杆菌属（Lactobacillus）占绝对优势;窖泥中主要优势菌有放线菌（Actinomyces）和乳杆菌属（Lactobacillus）和醋杆菌属（Acetobacter）。同一酒厂和不同酒厂新老车间酒曲、堆积、窖内发酵、窖泥之间细菌组成相似度较高,但其优势菌群丰度差异显著。发酵车间使用年限及窖龄影响着酿酒微生物多样性;使用时间长的车间和窖池其环境微生物种群结构更稳定,优势菌群更突出。     

泸州老窖窖泥中重要功能菌群分布及代谢产物研究

通过对泸州老窖酒厂不同窖龄窖泥中五大功能菌群的数量分布、生态结构的研究,发现甲烷菌、己酸菌、丁酸菌的数量随窖龄而增加。同时,窖泥中酸类和酯类微量化学成分含量和种类随功能菌数量同步增加。在传统工艺的长期影响下,在窖泥发酵方面形成了一个相对稳定的化学生态环境和固有的微生物区系生态结构,它们是生产优质浓香型白酒的基础。本研究进一步揭示了窖泥功能菌的生理特征和特殊功能,为多菌种混合发酵培养人工窖泥母液提供技术指导,以此培养出优质窖泥,提高浓香型白酒的质量和产量。     

川皖地区浓香型白酒窖底泥微生物菌群的多样性分析

以四川中部三大名优酒厂所取20年窖龄的窖底泥,以及在安徽某酒厂所取窖龄为20年的老熟、未老化和老化窖泥为研究对象.通过PCR-DGGE技术及Quantity One软件分析比对了各酒厂窖底泥的微生物群落结构.结果表明,与安徽某酒厂相比,四川3个酒厂的细菌群落结构极为相似,而各酒厂古菌菌群的差异较大;安徽某酒厂老化窖泥与其老熟及未老化窖泥相比,细菌和古菌菌群在数量和丰度上都有所降低,但是都有明显的优势菌存在.     

浓香型白酒窖泥变质前后古菌群落差异分析

窖泥是浓香型白酒的生命线,窖泥变质则为酒厂带来巨大损失。采用Illumina Miseq高通量测序DNA技术对窖泥变质前后古菌群落结构进行分析。通过构建古菌16S r DNA基因文库,结果表明,变质后窖泥共扩增出52876条序列,变质前窖泥扩增出11703条序列,古菌丰度有明显提高。对序列进行聚类、测序、分析,窖泥变质前优势古菌为:甲烷短杆菌属(35.66%)、甲烷杆菌属(10.25%)、类芽孢杆菌属(4.27%)、芽孢杆菌属(3.39%)、甲烷八叠球菌属(3.27%)等;窖泥变质后优势菌为:产甲烷袋菌属(38.18%)、甲烷杆菌属(34.21%)、甲烷袋状菌属(6.90%)等。结果揭示了甲烷菌是窖泥变质前后古菌的优势菌,为进一步研究窖泥微生物全貌及窖泥培养、养护提供依据。     

添加不同生物炭对人工窖泥培养微生物群落影响

基于高通量测序技术，分析添加不同生物炭对人工窖泥微生物群落结构、菌群网络及内部菌属与理化因子相关性的影响。结果表明，添加马弗炉慢速热解丢糟生物炭人工窖泥，微生物群落多样性、丰度及优势菌属(Clostridium＿sensu＿stricto＿12等)相对丰度更高；其不影响微生物网络稳定；窖泥微生物种群以Caproiciproducens等功能微生物为中心，并与Clostridium等功能菌菌属有较强相关性，从而有利于人工窖泥中Clostridium＿sensu＿stricto＿12等的富集，同时抑制Lactobacillus菌属生长，进而促进人工窖泥向优质窖泥转化。该文对不同生物炭添加至人工窖泥培养后微生物群落进行了分析，为揭示添加生物炭以加快人工窖泥向优质老窖泥转化提供了一定的微生物学理论基础。     

浓香习酒窖泥微生物菌群多样性及系统发育分析

窖池窖泥中微生物的分类鉴定对于分析窖泥的时间长短及其对酒的香味和风味影响发挥着非常重要的作用。运用多种微生物分子生态学技术手段对习酒酿酒窖泥细菌进行研究分析,结果表明,夏季老窖多粮窖壁泥中的细菌主要分为4个菌群:Petrimonas sulfuriphila,Thermacetogenium phaeum,Caloramator及不可培养的杆菌属;古菌主要分为2个簇:Methanoculleus和Methanoculleus palmolei。所有细菌都是厌氧的且大多数是嗜热或嗜温的,窖泥中细菌和古菌共同作用生成多种活性物质降解复杂的有机物,其代谢产物在窖池特定的环境中通过复杂的生理生化反应能形成浓香型白酒的特征风味因子。     

基于高通量测序技术的不同性状窖泥微生物组成研究

借助高通量测序技术,探讨了新泥、趋老熟、老熟、趋老化、老化等不同性状窖泥的微生物群落结构组成。结果显示,趋老熟和老熟窖泥微生物群落的多样性和丰富度均高于其他3种窖泥,且2者的群落分布特征比较相似。趋老熟、老熟窖泥中梭菌属(Clostridium)的优势较为明显,分别为总水平的17.55%和2.99%,而新泥、趋老化泥、老化泥中则以假单胞菌属(Pseudomonas)为绝对优势菌属,占总水平的69.68%、70.50%和72.84%。该研究初步揭示了不同性状窖泥的微生物群落结构差异,为研究判断窖泥性状的微生物组成提供了参考。     

宜宾地区不同性状窖泥的细菌群落结构解析及代谢功能预测

该研究基于16S r RNA V3-V4区基因序列,采用高通量测序技术对宜宾地区不同性状窖泥（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）的细菌群落结构差异进行分析,并采用PICRUSt预测不同性状窖泥微生物的代谢功能,解析宜宾地区不同性状窖泥的代谢功能差异。结果表明,该地区三种性状窖泥的细菌群落结构存在显著差异,老熟窖泥和老化窖泥细菌群落的丰富度高于新窖泥,而多样性相反。己酸菌属（Caproiciproducens）在老熟窖泥中的相对丰度较高,可能是该地区窖泥老熟的标志,该菌对浓香型白酒的风味物质形成具有重要的作用;乳酸杆菌（Lactobacillus）则在新窖泥中的相对丰度较高,可能是该地区新窖泥的标志。窖泥的碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能最强,且其相对丰度同样呈现出老熟窖泥>老化窖泥>新窖泥的变化规律,说明老熟窖泥的细菌群落结构对浓香型白酒风味物质的形成最有利。     

不同产区浓香型白酒窖泥中细菌多样性分析

以十里香窖泥(河北沧州)、景阳春窖泥(山东景芝镇)、泸州老窖窖泥(四川泸州)和龙江家园窖泥(黑龙江双城)为研究对象,利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和基因测序技术对窖泥中的细菌和乳酸菌的多样性进行分析。结果表明:在4种窖泥样品景阳春窖泥中细菌多样性最低,龙江家园窖泥中细菌多样性最高;十里香窖泥中乳酸菌的多样性最低,泸州老窖窖泥中乳酸菌的多样性最高。窖泥中的细菌以厚壁菌门为主,乳酸菌以乳酸杆菌为主,不同产区窖泥中细菌和乳酸菌的组成存在着差异。上述结果说明浓香型白酒窖泥中细菌多样性与其产区之间存在一定联系。     

不同窖龄窖泥原核生物多样性的高通量测序研究

窖池环境和其中多样的微生物构成了浓香型大曲酒发酵的特殊生态系统,其中蕴藏着丰富的微生物资源。试验通过对两个酒厂的新老窖池的不同取样位置的窖泥样品进行基于Illumina Miseq平台对细菌V3可变区进行高通量测序并结合理化性质的测定,研究各窖泥样品原核生物的群落结构,以及窖泥理化性质和窖泥中所含放线菌丰度的联系。研究结果初步表明,窖池老熟过程本质上是窖泥理化性质与其中微生物群落多样性交互作用的过程。     

提高浓香型大曲酒窖泥质量的研究

根据浓香型大曲酒窖池微生物培养技术理论,结合宏组学研究的成果,采用养窖工艺措施,对影响白酒发酵功能菌群生长代谢的窖泥的营养成分、水分及微生物区系等进行补给、调节,提高了窖泥活性、窖泥功能菌的数量和质量,每克干土总菌数提高了(0.7～2.0)×10~10个;每克干土杆菌数提高了(0.5～1.5)×10~9个。在曲酒车间16个生产班组的生产中,以窖龄较短的窖池的基酒质量提高明显,其中优级率比实施前提高了2.50%,一级率比实施前提高了3.70%。     

新老窖泥细菌群落结构差异及其对酿造白酒质量的影响

该实验选取六尺巷酒厂产酒质量低的新窖池窖泥及附近酒厂产酒质量良好的成熟老窖池窖泥,提取总脱氧核糖核酸（DNA）,对细菌16S rRNA的V3-V4区基因进行扩增、高通量测序后分析群落结构的差异。结果表明,螺旋菌门（Spirochaetae）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）是不同浓香型白酒生产厂窖泥样品（标记为YRF、XJF及CXF）中的共有优势微生物;梭菌纲（Clostridia）是成熟窖泥中的绝对优势微生物;在窖泥细菌的系统发育多样性上,新窖泥样品（标记为LCX）中梭菌纲与芽孢杆菌纲（Bacilli）的相对丰度显著低于成熟窖泥,是新窖池产酒质量比成熟老窖池差的主要原因。对窖泥细菌群落结构的分析有助于揭示浓香型白酒质量的成因。     

浓香型白酒发酵结束后不同层酒醅的微生物多样性分析

为研究浓香型白酒酒醅发酵结束时不同层酒醅中微生物多样性的不同,利用高通量测序研究了四川某著名浓香型酒厂出窖时面糟、上层、中层和下层糟微生物多样性。结果表明,出窖酒醅中绝对优势细菌是乳杆菌科(Lactobacillaceae),下层糟中普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)细菌显著高于其它部位。假丝酵母属(Candida)、双足囊菌属(Dipodascus)与拟威克酵母属(Wickerhamiella)是出窖糟中的主要真菌,面糟中拟威克酵母属和念珠菌属(Moniliella)丰度较上中下层糟高。     

基于高通量测序的浓香型窖泥原核微生物群落的窖池空间分布

利用Illumina Miseq高通量测序技术解析河南某酒企6年和12年窖泥微生物群落多样性和组成。结果表明,两类窖龄窖池中窖泥原核微生物群落组成具有相似的空间分布特征,且物种丰度（Chao1指数）和多样性（Shannon指数）均分别在窖壁中层和下层窖泥最高;乳杆菌属（Lactobacillus）、产己酸菌属（Caproiciproducens）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）及甲烷囊菌属（Methanoculleus）等14个属为窖泥优势属,其中78.6%优势属在两类窖龄窖池下部（下层和窖底）窖泥中含量均高于窖池上部（上层和中层）窖泥,且主要隶属于梭状芽胞杆菌纲（Clostridia）和拟杆菌纲（Bacteroidia）;57.6%（19/33）Top10属的空间分布特征与窖龄无关;随窖龄增加,Top10属产生了132个变化,其中75.6%的变化均较小（＜1%）;冗余分析（RDA）结果推测,铵态氮和有效磷可能是影响供试窖泥原核微生物菌群空间分布的主要环境因子。     

对窖泥人工老熟的一点认识

近十多年来,扩大培养己酸菌的人工老熟窖泥方法在全国已推广起来,浓香型白酒在各地也大批涌现;但此法仅仅是突出了己酸乙酯的香味,尚不具备名优酒的风味芳香,解决不了一些名优酒厂窖泥退化和新建窖前期不产好酒的问题。据有关单位分离鉴定,窖泥微生物中,好气性的占50%,兼性嫌气性的占27%,厌氧性的占23%。由此看来,单纯培养其中少量的厌氧性——产己胶菌是没有代表性的。且近代仪器分析表明,浓香型名优酒中的香味成份已达150种以上;虽然浓香型大曲酒