缓释定向释放型IgY微胶囊的制备及其效果评价

目的制备缓释定向释放型IgY微胶囊,并评价其效果。方法采用喷雾干燥法,以明胶、海藻酸钠为微胶囊壁材,制备抗仔猪病原性腹泻IgY微胶囊。以IgY的活性、包封率、体外释放性能及稳定性为评价指标,通过单因素分析和L_9(3_4)正交试验,分别从成囊材料的配比对微胶囊性能的影响、制备微胶囊成囊乳化液的稳定性影响因素以及喷雾干燥条件3方面对IgY微胶囊制备条件进行优化,并评价微胶囊的IgY活性、包封率、在人工胃液(simulated gastric fluid,SGF)和人工肠液(simulated intestinal fluid,SIF)中的缓释效果及稳定性。结果筛选出的制备微胶囊的最佳工艺条件为:明胶浓度4%、海藻酸钠浓度0.75%,按IgY与明胶-海藻酸钠质量比为3∶4加入IgY,乳化后按进风温度170℃,进料速度10 ml/min,干燥时间10 s,出口温度70℃进行喷雾干燥。在此工艺条件下制备的IgY微胶囊包封率为77.4%,活性保持在85%以上;在SGF中2 h释放率为8.6%,在SIF中4 h释放率为81.2%;90℃加热30 s仍可保持50%以上的活性,常温(25~30℃)放置10个月活性仍保持在90%以上,4℃保存10个月活性仅下降5%。结论本工艺制备的明胶-海藻酸钠IgY微胶囊具有生物活性高,稳定性强的特点,且对特异性IgY具有缓释和靶向作用。     

硫糖铝对抗幽门螺杆菌重组VacA卵黄抗体的保护作用

目的观察硫糖铝对抗幽门螺杆菌重组细胞空泡毒素抗原(VacA)卵黄抗体(IgY)的保护作用,为制备能耐受胃酸和蛋白酶的IgY制剂奠定基础。方法诱导重组菌DH5α-vacA-pQE30,大量表达并纯化VacA重组蛋白,免疫洛曼母鸡,制备VacAIgY,并进行纯化。在不同pH值的IgY液中加入不同浓度的硫糖铝和不同浓度的胃蛋白酶,将含不同浓度硫糖铝的IgY反复冻融7次,将含30%硫糖铝的IgY室温放置1d～4周,ELISA法测定各实验组IgY的相对抗体活性(AT/AC)。结果在pH1.5、2.0和3.0的条件下,含30%～60%硫糖铝的IgY的相对抗体活性高于不加硫糖铝的IgY;在pH1.5条件下,60%硫糖铝可使IgY的相对抗体活性保持68.7%;在pH2.0和3.0条件下,50%和40%以上的硫糖铝几乎可完全保持IgY的相对抗体活性。在pH值为2.0和3.0时,正常胃蛋白酶浓度(0.02mg/ml)下,30%以上的硫糖铝均可有效保护IgY的相对抗体活性。30%以上的硫糖铝可增强IgY的抗冻融能力。室温放置4周后,含30%硫糖铝的IgY仍能保持80%以上的相对抗体活性。结论30%以上的硫糖铝可增强VacAIgY对低pH和胃蛋白酶的耐受能力及抗冻融能力,是较理想的IgY保护剂。     

抗甲型肝炎病毒卵黄免疫球蛋白的制备及应用

目的制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量。方法用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAV IgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性。以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78%;效价最高为1∶16 000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25⁷0℃条件下处理15 min及经pH 3.070℃条件下处理15 min及经pH 3.0¹0.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.6210.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62² 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,最低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7。结论制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量。     

抗咽喉炎常见菌IgY抗体的制备及其特性的研究

目的制备抗β-溶血性链球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌3种咽喉炎常见菌IgY抗体,并分析其特性。方法采用超声波破碎法将3种咽喉菌制备成可溶性抗原液,免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取IgY抗体,应用免疫电泳、ELISA、SDS-PAGE检测抗3种咽喉菌IgY抗体的特性及热稳定性。结果抗原免疫母鸡10d后,鸡蛋黄中即有抗3种咽喉菌的IgY抗体产生,60d时抗体滴度高达1∶102400,IgY抗体滴度在室温可保持5~6个月不变。结论制备的抗3种咽喉菌IgY抗体滴度高,特异性强,稳定性好。     

鸡卵煮沸对菌痢和轮状病毒特异性IgY活性的影响

目的探讨鸡卵煮沸对特异性IgY活性的影响,为食用特异性IgY防治消化道传染病奠定基础。方法用福氏志贺痢疾菌及轮状病毒Wa株免疫母鸡,制备特异性IgY。将含特异性IgY的鸡卵煮沸不同时间,观察卵清及卵黄性状;提取煮沸4min、6min和4℃对照的鸡卵特异性IgY,采用凝集试验、乳鼠抑菌试验及ELISA,检测鸡卵特异性IgY的活性。结果含特异性IgY的鸡卵煮沸4min,卵清与卵黄容易分离,与4℃保存的鸡卵特异性IgY活性差异无统计学意义;但煮沸6min时,卵清完全凝固,特异性IgY活性明显下降。结论鸡卵煮沸4min,对特异性IgY活性无明显影响,可直接食用煮沸4min的鸡卵,用于消化道疾病的防治。     

抗金黄色葡萄球菌及溶血性链球菌IgY的制备及临床疗效观察

目的制备抗金黄色葡萄球菌及溶血性链球菌鸡卵黄IgG(IgY),并观察其治疗急性咽炎的临床疗效。方法将金黄色葡萄球菌及溶血性链球菌混合免疫母鸡,使用水稀释法、超滤法、西曲溴胺除脂法和硫酸铵盐析法提取、纯化IgY后,经全面检定,对110例急性咽炎进行临床疗效观察,治疗组60例,使用0·2%IgY口腔喷剂治疗7d;对照组50例,口服双黄连胶囊7d。结果IgY粗提物和纯化物纯度分别为41·6%和96·0%,效价分别达1∶1024和1∶8192;IgY粗提物在pH2·07~11·71条件下7d,效价基本不变;2·5~10·0mg/ml的纯化物抑制率为20·81%~68·11%。治疗组治愈率为26·67%,显效率为36·37%,有效率为30·00%,无效率为6·67%,总有效率为93·33%;对照组治愈率为12·00%,显效率为18·00%,有效率为44·00%,无效率为26·00%,总有效率为74·00%,差异有非常显著意义(P<0·005)。治疗组未见毒副作用。结论金黄色葡萄球菌及溶血性链球菌能够诱导母鸡产生特异性抗体,治疗急性咽炎疗效显著、安全。     

酸性条件下糖对抗HpaAIgY的保护作用

目的探讨酸性条件下5种糖对抗HpaA蛋黄抗体(IgY)的保护作用,为寻找提高IgY耐酸性的保护剂,制备口服防治幽门螺杆菌(H.pylori)感染的IgY制剂提供理论依据。方法建立检测抗HpaAIgY的间接ELISA法,用不同pH值的模拟胃液分别配制IgY液(IgY终浓度为1.0mg/ml),以pH1.0、2.0和3.0的模拟胃液分别配制含20%菊糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖的IgY液(IgY终浓度为1.0mg/ml),用pH2.0的模拟胃液分别配制含不同浓度的菊糖、山梨醇的IgY液(IgY终浓度为1.0mg/ml)。上述IgY液均于37℃孵育2h,采用间接ELISA法测定IgY的抗体效价。结果 IgY的活性随着模拟胃液pH值的降低而明显下降;在酸性环境下,5种糖对IgY均有一定的保护作用,以山梨醇和菊糖的保护作用较强;在pH2.0时,40%山梨醇和30%菊糖对IgY的保护作用最强,分别能保存80.3%和73.4%的IgY活性。结论在酸性条件下,糖对IgY均有一定的保护作用,菊糖和山梨醇可作为特异性IgY的保护剂。     

鸡卵抗体(IgY)理化特性的研究

本文研究了抗脊髓灰质炎病毒Ⅲ型鸡卵抗体（IgY）的理化特性，实验证明IgY在室温条件下能保持活性6个月，经巴氏消毒后抗体活性不丧失，并且具有很好的耐酸性，研究结果提示特异性IgY可作为良好的婴幼儿食品添加剂。     

冻干人血浆补体的制备及其稳定性

目的制备冻干人血浆补体,并观察其在4种不同保存温度条件下的稳定性。方法制备3批冻干人血浆补体,将每批样品分别保存在-70、4、25和37℃条件下,采用补体50%溶血试验测定于-70和4℃条件下保存第1、15、30、60、90、120、180、270、365天以及于25和37℃条件下保存第1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120天的CH_(50);细胞增殖-毒性检测法测定补体对抗CD_(20)抗体CDC活性检测的影响。结果-70和4℃保存的3批冻干人血浆补体,1年内CH_(50)平均下降了19.5%和36.3%,25和37℃保存的3批冻干人血浆补体,3个月CH_(50)平均下降了53.4%和60.7%。与上市补体和CH_(50)为30 U/ml的冻干人血浆补体相比,CH_(50)为15 U/ml的冻干人血浆补体对抗CD_(20)抗体CDC活性检测结果无影响。结论在-70和4℃条件下保存的冻干人血浆补体的CH_(50)相对较稳定,但随着保存温度的升高,CH_(50)下降有加速的趋势。CH_(50)大于15 U/ml的冻干人血浆补体可用于治疗性抗体CDC活性检测。     

佩兰中黄酮类化合物的提取及抑菌活性研究

用正交试验法确定了超声提取佩兰黄酮类化合物的最佳工艺参数。最佳提取条件为：70％乙醇为溶媒,超声功率为50kHz时,超声时间30min、超声温度40℃、物料比1：15,提取4次,在此条件下能达到最佳的提取效果,稳定性良好。对佩兰提取的黄酮成分进行抗菌研究发现,其对四联球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌具有一定的抑菌作用。     

抗流感病毒鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备和性质

用流感病毒免疫产蛋鸡,获得的免疫卵黄经两步盐析和一步凝胶过滤分离得到的IgY经SDS-PAGE分析其纯度在95%以上,纯化的IgY经胃蛋白酶(pH=4 0,37℃)酶解后,得到的片段抗体为Fab。采用竞争抑制ELISA法对IgY和Fab的免疫反应活性进行了对比,表明IgY经胃酶切解后保留了约70%的反应活性。     

丙酮提取菠萝皮抑菌物的条件研究

采用正交试验法研究丙酮提取菠萝皮抑菌物质的工艺条件。实验结果表明,提取物对大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用,对桔青霉则无抑制作用。对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌效果最佳的提取工艺条件为：料液比1∶30,丙酮浓度75%,提取时间40 min,提取温度70℃。对金黄色葡萄球菌最佳的提取工艺条件为：料液比1∶10,丙酮浓度65%,提取时间40 min,提取温度50℃。在优化条件下,菠萝皮的丙酮提取物对大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌的MIC分别为60、100、250mg·m L^-1。     

奶粉中金黄色葡萄球菌标准样品的均匀性和稳定性研究

对人工制备的奶粉中金黄色葡萄球菌标准样品进行均匀性和不同储存条件下稳定性的实验研究。奶粉中高密度菌体和低密度菌体标准样品的均匀性统计学结果变异小,均匀性良好;两种密度菌体在-80℃保存半年后,活菌数没有显著变化,符合稳定性统计学要求,提高保存温度之后,低密度菌体标准样品可以在-20℃下保存半年以上,而高密度菌体标准样品的活菌数在-20℃下保存40 d后开始下降,直到70 d后达到稳定,继续提高保存温度,高密度菌体标准样品在4℃下保存稳定性较差,而低密度菌体标准样品在4℃可以稳定7 d。综上所述,低密度菌体的奶粉中金黄色葡萄球菌标准样品可以满足实验室质量控制和方法验证的基本需求,保障量值准确统一,保证检测结果的有效性、可比性及国际国内互认度。     

放线菌MY-048菌株中活性成分的初步研究

从四川绵阳地区的药用植物根际分离筛选到一株放线菌MY—048菌株,其发酵液对几种细菌有抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌的作用效果明显。对发酵液进行稳定性测定,结果表明MY—048的发酵液在中性及酸碱条件下都稳定,在强酸和强碱条件下抑菌活性丧失:发酵液能经受75℃水浴60 min仍保持原来的抗菌活性,温度升高到100℃时活性丧失;对MY—048的生长与活性物质产量进行比较,发现在培养的144 h时活性物质的产量及菌体生长量均达到最高峰;通过硅胶柱层析,制备型薄层色谱,得到一个有活性的化合物,高压液相(HLPC)检测纯度为97%。     

半枫荷叶总多酚提取工艺优化及抗菌活性研究

以半枫荷叶为原料,对半枫荷叶总多酚的最佳提取工艺以及抗菌的活性进行研究。通过单因素试验和正交试验优化半枫荷叶总多酚的热回流提取工艺。采用牛津杯法和试管二倍稀释法研究半枫荷叶总多酚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌活性。结果表明最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数为70%,料液比为80 mL·g~(-1),提取时间60 min,提取温度80℃;在最优条件下提取率为(4.07±0.0149)%,总多酚对金黄色葡萄球菌的抑菌圈(IZ)为(7.25±0.433) mm,最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)均为5.00 mg·mL~(-1)。但对大肠杆菌的抑制效果不明显。研究结果表明,半枫荷叶总多酚热回流提取工艺稳定,对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用,为开发利用半枫荷叶提供理论依据。     

十二烷基二甲基苄基氯化铵的低温杀菌效果

利用D/E中和肉汤做中和剂,采用载体浸泡杀菌实验方法考察了十二烷基二甲基苄基氯化铵1227在–18℃条件下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭效果.结果表明,D/E中和肉汤作为1227实验溶液对金黄色葡萄球菌杀菌实验的中和剂选择合格;质量浓度为0.5％的1227对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作用15 min,杀灭对数值均大于3...     

胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响

目的 观察抗狂犬病毒IgY经胃蛋白酶酶解24h后，抗体活性的变化。方法 高效价抗狂犬病毒IgY粗提后，经胃蛋白酶酶解，纯化，用ELISA及小鼠中和实验测其抗体活性。结果 获得单一IgY解片段并能够中和狂犬病毒。结论IeY经胃蛋白酶酶解24h仍保持其中和抗体的活性，为制备口服免疫制剂奠定基础。     

一种复合双链季铵盐消毒剂低温消毒研究

研究一种复合双链季铵盐消毒剂低温消毒性能,通过低温载体浸泡定量杀菌实验及模拟现场杀菌实验评估消毒剂的现场杀菌效果。实验结果表明,该消毒剂在-20 ℃存放时间大于8 h,样品无析出无结晶,-20 ℃该消毒液原液载体上的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作用15 min的杀灭对数值均大于3.0;经30份检测样本实验表明,在-20 ℃条件下,消毒剂对硬质物体表面模拟消毒作用30 min,对样本的模拟菌种(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)杀灭对数值大于3.0。     

二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定

目的构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定。方法利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变的方法,构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosy)l对表达的目的蛋白进行可溶性纯化,并进行抗原结合活性、相对稳定性及细胞毒中和活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。抗TNF-α的ds-scFv的表达量占菌体总蛋白的16.6%,主要以包涵体形式表达;纯化的目的蛋白纯度可达94.4%;经ELISA及Western blot验证,ds-scFv与TNF-α抗原的结合活性与scFv相近;相对稳定性优于scFv;在同样的抗体浓度下,scFv和ds-scFv的细胞毒中和活性略低于亲本鼠单抗,ds-scFv略高于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达质粒,并获得有活性的目的蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

抗轮状病毒IgY和Fab'的分离与纯化

抗轮状病毒IgY可用两步盐析结合凝胶过滤从蛋黄中分离出来,用SDS—PAGE检测其纯度可达到95％以上。纯的IgY经胃蛋白酶分解得到的抗体片断（Fab’）,经SDS-PAGE和MALDI质谱法测定,其纯度达到99％以上。结果表明,所设计的分离抗轮状病毒IsY和Fab’的方法简单、有效。经ELISA法检测,Fab’的活性仍保持在IgY原始活性的70％以上。