芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH 值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对oNP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。     

提高α-半乳糖苷酶稳定性的研究

研究了臭曲霉ZU—Gl产α-半乳糖苷酶的热稳定性提高方法及其相应措施。针对提高α-半乳糖苷酶制剂热稳定性的问题,研究了添加物质对酶热稳定性的影响。结果表明,甘露醇对α-半乳糖苷酶的保护效果最好,其次是棉籽糖、海藻糖和蜜二糖;L-半胱氨酸、黄原胶和甘油也起到了较好的保护作用。采用正交实验设计优化出最佳保护剂配方,即1.75mmol/L的海藻糖,1.5mmol/L的甘露醇和2mmol/L的棉籽糖。复合保护剂的添加使α-半乳糖苷酶在30～60℃时酶活保留率提高11.6%～21.7%;在pH3.0时酶活保留率提高52%。α-半乳糖苷酶在28℃、36.2℃和45℃下贮存,添加保护剂组酶活损失50%的时间分别为89.5d、38.4d和8.4d,对照组分别为40.9d、23.3d和7.79d。     

高效利用棉籽糖菌种的筛选及酶学性质研究

为筛选出可高效利用棉籽糖的菌种并对其酶学性质进行研究,采用高效液相色谱法测定了棉籽糖含量,平板计数法测定菌种生长量,p NPG法测定α-半乳糖苷酶酶活。结果显示,该实验筛选出屎肠球菌、粪肠球菌和凝结芽孢杆菌3株可以高效利用棉籽糖的菌种,发酵后培养基中棉籽糖剩余含量分别为0、0. 36%和1. 05%(质量分数)。屎肠球菌α-半乳糖苷酶最适p H值为5,最适温度为45℃。粪肠球菌α-半乳糖苷酶最适p H为5,最适温度为50℃。凝结芽孢杆菌α-半乳糖苷酶最适p H为8,最适温度为45℃。所产α-半乳糖苷酶具有较为稳定的酶学性质,可为今后饲料和食品中棉籽糖的去除提供研究方向。     

半乳糖苷酶基因重组酵母的酒精发酵

半乳糖苷酶催化半乳糖苷键的水解,包括α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶。就半乳糖苷酶的应用研究,尤其是半乳糖苷酶遗传修饰酵母在酒精发酵中的作用进行了简要综述。     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

Kluyveromyces fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的摇瓶培养条件

脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)LFS 8611合成的β D 半乳糖苷酶具有较高的催化半乳糖基转移反应活力.脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)LFS 8611细胞生长和β D 半乳糖苷酶的合成同步.该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之;最适氮源为蛋白胨F403;最适培养条件为:发酵培养基的初始pH值为7.0,摇床的转速为200r/min.培养基中碳源和氮源质量浓度对菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力有重要影响,以12mg/mL乳糖为碳源,16mg/mL蛋白胨(F403)为氮源,在最适培养条件下培养32h后,菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力分别为7.56g/L和18.83U/mL.     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

微泡菌ALW1重组β-半乳糖苷酶的异源表达和酶学性质

β-半乳糖苷酶催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,是乳制品加工中重要的酶。该研究将微泡菌ALW1菌株的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达和纯化,研究其酶学性质。结果表明,微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶属于GH1家族,利用Ni-NTA Agarose亲和层析获得的重组β-半乳糖苷酶分子量约为64 ku。重组酶的最适反应温度为30 ℃,最适pH为4.5。温度低于25 ℃、pH 4.0~5.0条件下,β-半乳糖苷酶具有良好稳定性。重组β-半乳糖苷酶对DTT、吐温20和吐温80具有良好的耐受性;离子型去垢剂SDS和CTAB存在时,β-半乳糖苷酶几乎丧失活性。重组β-半乳糖苷酶的Km和Vmax分别为10.98 mmol/L和7.48 U/mg。结构模拟显示,微泡菌β-半乳糖苷酶的催化酸/碱残基和亲核残基分别为Glu186和Glu370。该研究为来自微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶在食品领域的应用奠定理论基础。     

β-半乳糖苷酶交联酶聚体的制备及酶学性质研究

研究了乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶交联酶聚体(CLEAs)的制备条件和酶学性质,并应用于乳糖为底物催化制备低聚半乳糖(GOS)的反应体系中。结果表明:将β-半乳糖苷酶酶液稀释20倍,按体积比1∶1加入异丙醇,4℃下沉淀30min,加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛,4℃下交联30min,离心洗涤,所得CLEAs的酶活保留达45.77%;与游离酶相比,β-半乳糖苷酶CLEAs的最适p H由7提高至8,最适温度由30℃提高至37℃,p H和温度的适用范围有所拓宽,且37℃下热稳定性提高1倍,具有更高的转糖苷活性选择性,适于制备功能性低聚半乳糖。     

臭曲霉ZU-G1 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为明确臭曲霉ZU-G1分泌的α-半乳糖苷酶的酶学性质,采用硫酸铵沉淀、分子筛层析和阴离子交换层析等方法进行分离纯化.试验结果表明:α-半乳糖苷酶的分子质量136.71 kDa,反应最适pH 5.0,最适温度60℃;在30～40℃环境中热稳定性较好,在pH 6.0环境中酸碱稳定性较好.该酶受Ag+和十二烷基磺酸钠的强烈抑制(抑制率分别为100%和93%)、Cu2+的明显抑制,而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、棉籽糖、乙二胺四乙酸和巯基乙醇对酶活性影响较小.该酶对pNPG的米氏常数Km=33.48 mmol/L,最大反应速度Vmax=238.09 mmol/(L·min).本试验结果为α-半乳糖苷酶在饲料和食品中的应用提供了一定的理论基础.     

生物合成α-半乳糖苷酶的研究进展

半乳糖苷酶是一种外切糖苷酶,可用于改善和消除饲料及豆制食品中的抗营养因子,良好的生物催化能力使其在食品、饲料和医药等领域显示出巨大潜力,但目前α-半乳糖苷酶的微生物发酵产量及活性并不高。该文在阐述α-半乳糖苷酶的催化机制的基础上,对α-半乳糖苷酶的微生物来源,产α-半乳糖苷酶菌株的发酵以及该酶的异源表达和分离纯化进行了综述,并对开发低成本、高活性和高产量的α-半乳糖苷酶生产工艺进行展望,以期显著提高α-半乳糖苷酶的生产水平,为后续对α-半乳糖苷酶的产业化研究奠定基础。     

分枝犁头霉WL511热稳定α-半乳糖苷酶基因克隆及序列分析

构建并筛选耐热分枝犁头霉cDNA文库获得639 bp热稳定α-半乳糖苷酶基因片段,并以5′-RACE和3-′RACE技术获得上下游片段1817 bp和1092 bp,拼接得α-半乳糖苷酶全长序列2228 bp,其完整开放读码框为2142 bp,编码713个氨基酸,G+C含量43%;产物预测等电点5.2,预测相对分子质量81000。该基因(GenBank No.DQ234280)属α-半乳糖苷酶36家族,与其他来源的α-半乳糖苷酶基因同源性较低,与链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680的α-半乳糖苷酶同源性最高为38%。     

Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

低聚半乳糖具有促进肠道有益菌增殖、抗龋齿、低能量等特定的生理功能。研究了酶反应条件对脆壁克鲁维酵母(kluyveromyces fragilis)β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的影响。以乳糖为底物,k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,反应20h低聚半乳糖的产率达到最大。底物初始浓度影响k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的产率,乳糖起始浓度由110mg/mL增加到660mg/mL,低聚半乳糖的含量从43mg/mL增加到207mg/mL。     

碳源对Bacillus cereus CZ氨肽酶产量及糖代谢酶活性的影响

本文对Bacillus cereus CZ生产亮氨酸氨肽酶(LAP)进行了研究。结果表明,L-阿拉伯糖最利于LAP生产,D-半乳糖和乳糖也有较好效果,葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或碳酸氢钠则强烈抑制LAP产生。L-阿拉伯糖和单糖混合、乳糖或半乳糖与葡萄糖混合均大大降低LAP产量。乳糖、葡萄糖有利于细胞生长。2%的乳糖、半乳糖或阿拉伯糖作为碳源,发酵48 h时LAP产量并没有达到最高。对于三种糖代谢酶,β-半乳糖苷酶受乳糖强烈诱导,D-半乳糖则强烈抑制该酶的活性,半乳糖激酶受D-半乳糖强烈诱导。L-阿拉伯糖异构酶受L-阿拉伯糖强烈诱导。当L-阿拉伯糖和半乳糖的浓度为4%时,LAP产量达到最高。胞外半乳糖激酶随D-半乳糖增加而降低,而胞内正好相反。L-阿拉伯糖异构酶活性随L-阿拉伯糖浓度增加而增加。当L-阿拉伯糖为4%时,LAP产量在发酵56 h达到最高,但在半乳糖为4%时,LAP产量随时间延长而增加。     

鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶的分离纯化和性质研究

目的从鲜地黄分离纯化β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶,并研究其性质。方法通过磷酸盐缓冲液提取、两步硫酸铵盐析和两步凝胶柱层析,分离纯化鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶。以pNPG为底物,研究两种酶的最适反应温度及温度稳定性。结果与结论从鲜地黄中分离得到1种β-葡糖苷酶和3种α-半乳糖苷酶同工酶。研究发现β-葡糖苷酶热稳定性较差,在50℃即迅速失活;而α-半乳糖苷酶在50℃总酶活性最高,热稳定性较好,70℃以上时活性迅速下降。     

Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及其酶学性质

本文利用大肠杆菌原核表达系统对来源于Geobacillus thermodenitrificans的α-半乳糖苷酶编码基因进行了重组表达,并对该酶的酶学性质进行了研究。结果表明,该α-半乳糖苷酶的分子量为100~110 kDa,以pNPG为底物时,该酶的最适反应温度为70 ℃,最适pH6.0,且该酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性;Hg+、Ag+、Cu2+离子能完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,Fe3+、Mn2+、Zn2+等离子对α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用;以pNPG为底物测得该酶的米氏常数K_m=10.04 mmol/L,最大反应速度V_max=18.25 μmol/min。     

α-半乳糖苷酶的研究进展概况

论述了α-半乳糖苷酶性质、应用及国内外的研究概况,并简单介绍了本实验室利用生物技术将毛霉中克隆到的α半乳糖苷酶基因转化至酵母高效表达的研究情况.     

基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究

探究了磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶对乳酸乳球菌乳糖代谢的影响。通过对12株乳酸菌在以乳糖为单一碳源环境下的生长、产酸、乳糖代谢情况、β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力及发酵液中残留半乳糖含量进行测定,了解不同菌株乳糖代谢的差异。结果表明,不同的乳酸乳球菌乳糖代谢能力存在显著性差异;β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为270～4 110 mg/L,而磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为40～900 mg/L;将磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配,发酵液中半乳糖含量较嗜热链球菌单菌发酵时显著降低。磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌有助于降低发酵乳制品中的半乳糖含量。     

海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

研究了强化海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶的方法以及固定化酶的性质,并用于制备低聚半乳糖。研究表明,用海藻酸钙包埋、戊二醛进行交联、对β-半乳糖苷酶进行固定,方法简便、酶的活力回收率高。所得固定化酶强度和活力高,对热、pH值耐受范围较游离酶宽,最佳反应温度和pH与游离酶相同,且贮存稳定性好。以乳糖为原料,用海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖,随着时间的延长,低聚半乳糖合成率呈抛物线变化。在温度55℃、pH6.0、乳糖浓度40%、反应时间为30h时,低聚半乳糖的合成率达最大值36.37%。     

α-半乳糖苷酶的液体发酵条件和酶学性质研究

研究了臭曲霉ZU-G1液体发酵产α-半乳糖苷酶的最佳生产条件及其酶学性质.试验结果表明,最适发酵条件为温度28℃.转速200 r/min,装液量30 mL(250 mL三角瓶),接种量6.6%,种子培养18 h后接种,发酵144 h后α-乳糖苷酶酶活达到最大值.在此发酵条件下α-半乳糖苷酶最适pH 5.0,于28℃放王7 h,在pH 3.5～6.0内稳定性较好;该酶的最适温度为60℃,在50℃以下存放稳定性较好.Ag 可强烈抑制该酶的活性,Ca2 、Mg2 、Mn2 和Zn2 的激活效果随浓度而变.1mmol/L甘露醇、抗坏血酸和2mmol/L蜜二糖对酶的热稳定性保护效果好.