黑曲霉H1-9b 葡萄糖氧化酶的分离纯化及部分性质研究

采用研磨法破碎黑曲霉H1-9b 菌丝体,经pH5.7 磷酸缓冲液抽提获得粗酶液,粗酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200 凝胶过滤层析,得到葡萄糖氧化酶纯品。该酶的比活力为30569.7U/mg,回收率为30.2%,提纯倍数为41.4 倍,分子质量为94.1kD,为单亚基酶。该酶最适温度为37℃,最适pH 值为5.7,在30～40℃温度范围内稳定性较好,在pH4.0～8.0 范围内活性稳定。以不同浓度葡萄糖为底物在最适条件下测得该酶K_m 值为30.69mmol/L,V_max 为21.88μmol/L。Ag^+、Cu²⁺、Zn²⁺ 对该酶活性有较大抑制作用。结果表明,该酶稳定性较好,有一定的应用价值。     

酶法水解大豆异黄酮

利用Absidiasp R菌株 ,通过液体发酵 ,得到了一种高活性的大豆异黄酮糖苷水解酶 ,该酶水解糖苷型大豆异黄酮的最适底物浓度为 7 5mg/mL ;最适反应时间为 1 5h ;该酶在温度为 2 0～5 0℃、pH为 4 0～ 7 0范围内相对稳定 ,最适酶解反应温度为 40℃ ,最适pH值为 5 0 ;金属离子对该酶活力的影响不显著 ,其中Co2 +、Zn2 +对该酶有激活作用 ,Ag+、Cu2 +对该酶有抑制作用 ,Fe3+浓度<5 0mmol/L时 ,对该酶有促进作用 ,当离子浓度 >5 0mmol/L时 ,则有抑制作用。利用实验获得的最适酶解条件反应 ,可使染料木苷生成染料木素的转化率达到 1 0 0 %。     

大豆过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

新鲜大豆芽经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的过氧化氢酶。该酶酶活回收率为30.92%,纯化倍数为293.09,酶比活力达到26 322.43 U/mg。该酶全分子质量为234.9 kD,亚基分子质量为57.42 kD;最适pH值为7.2,最适温度为30 ℃,在pH 4.0～10.6及25～35 ℃范围内有较好的稳定性;在30 ℃、pH 7.2条件下测得该酶对过氧化氢的Km值为31.82 mmol/L;十二烷基硫酸钠、草酸、Ag+、Cu2+对该酶有强烈的抑制作用,Pb2+对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用而高浓度时抑制酶活性。     

蕹菜叶酪氨酸酶的分离纯化与部分性质

蕹菜叶经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的酪氨酸酶。该酶活力达到114.53 U/mg,酶活力回收率为11.33%,纯化倍数为99.59。全酶分子质量为77.60 kD,亚基分子质量为38.70 kD;最适温度为45 ℃,最适pH值为7.5,该酶在25～55 ℃及pH 6.0～8.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其Km值为10.05 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及柠檬酸、抗坏血酸、Ca2+和Pb2+对该酶有抑制作用,Mn2+、Zn2+和Co2+对该酶具有一定的激活作用,尿素和十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfonate,SDS）对该酶活性影响不大,Li+、K+对该酶活性基本没有影响。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

丝瓜过氧化物酶的特性和抑制作用研究

研究丝瓜过氧化物酶最适温度、最适pH值、Km、Vmax及最适底物,同时通过正交试验探讨不同抑制剂组合对丝瓜过氧化物酶的抑制作用.结果表明,丝瓜过氧化物酶最适温度为45℃,最适pH值为5.0,以邻苯三酚为最适底物,Km=0.001516 mol/L,Vmax.=440.7U/(min·g).正交试验结果表明,最佳抑制剂组合为6mmol/L柠檬酸+6mmol/L EDTA+6mmol/L半胱氨酸+6mmol/L VC.在此条件下抑制率为58.89％.     

Enterococcus faecalis RQ15产低温中性蛋白酶的纯化及酶学性质

采用DEAE Sepharose Fast Flow和SuperdexTM 75对Enterococcus faecalis RQ15产蛋白酶进行纯化和酶学性质研究。SDS-PAGE测定该蛋白酶分子质量为32.4kD,最适作用温度35～40℃,最适pH7.5。20～40℃之间酶活较高,pH值耐受范围广泛,具有低温蛋白酶的特征。Zn2+对蛋白酶有激活作用,Ag+、Hg2+和EDTA-Na2对酶有显著抑制作用。纯酶最适作用条件下对酪蛋白底物的Km和Vmax分别为1.31×10-4mol/L和6.92×10-6mol/(L ·s)。     

黄瓜过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

新鲜的黄瓜经匀浆、抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶。该酶的比活力、回收率及纯化倍数分别为64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。该酶的分子质量为41.15 kD,亚基分子质量为40.21 kD。该酶的最适温度和最适pH值分别为60 ℃和6。在25～45 ℃及pH 5～9的范围内非常的稳定。在测定条件下测得该酶的Km值为53.79 mmol/L。硫氰化钾对该酶活力基本无影响。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+对该酶都具有激活作用且浓度至50 mmol/L时酶活力分别被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%,然而十二烷基磺酸钠、抗坏血酸和草酸对该酶有强烈的抑制作用;Zn2+、甲醇、乙醇和异丙醇对该酶有一定的抑制作用。     

韭菜过氧化物酶的分离纯化及性质

经匀浆、抽提、硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的韭菜过氧化物酶(POD)。该酶比活力达到14031.41U/mg,纯化倍数为102.96,回收率为10.85%。该酶分子质量约为28.4kD,最适温度40℃、最适pH值为4.6。该酶在20～40℃以及pH 4.0～8.0有较好的稳定性,在最适条件下测得其Km值为18.15mmol/L。低浓度草酸、Zn2+、Mg2+等对该酶有较强激活作用;甲醇、乙醇、异丙醇、SDS、抗坏血酸(AsA)以及Mn2+、Fe3+等对该酶有较强的抑制作用。     

藏灵菇源克鲁维酵母K1菌株胆盐水解酶的特性研究

探讨藏灵菇马克斯克鲁维酵母K1菌株胆盐水解酶作用底物的反应条件与不同化学试剂对酶活性的影响及其发酵动力学类型。采用单因素多水平试验方法,在pH值4～8、温度31℃～43℃、底物浓度4mmol/L～8mmol/L及不同化学试剂(SDS、EDTA、尿素、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Mn2+)的条件下,胆盐水解酶与底物反应30min,检测酶活力;平板活菌计数法分析细胞生长与产酶的关系;双倒数作图法求得酶促反应动力学常数Km。结果表明,胆盐水解酶最适反应条件为:pH值为6.0、底物浓度7mmol/L、温度37℃,Fe3+、Ca2+、Mn2+及尿素对酶活性有较大提高作用,Mg2+、Al3+及SDS对酶的激活作用次之,Cu2+及EDTA对酶活性影响不大。K1菌株在18h～21h进入稳定期,于21h对数生长期的末期时酶活性达到最高,表明其胆盐水解酶发酵动力学类型为生长偶联合成型。其酶促反应动力学常数Km为2.10mmol/L,说明该酶与最适底物的亲和力较大。     

热稳定酸性β - 葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌丝体破碎液依次经过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等步骤处理,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE显示其分子质量为125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最适pH值为3.0～4.0,最适温度为70℃,表观米氏常数(Km)值为2.35mmol/L,表观kcat/Km值为2.99×104L/(mol ·s);水解京尼平苷、水杨苷的表观kcat/Km值分别是1.26×104、1.37×104L/(mol ·s);水解活性受Mn2+的显著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等离子的微弱抑制。该酶活性在pH2.0～8.3保持稳定;酶在65℃时保温60min,残余酶活达到了85%,是一种热稳定酸性β-葡萄糖苷酶。     

杂优-2平菇漆酶的分离纯化及酶学性质

将杂优-2平菇菌丝进行液体培养,发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fastflow层析和Superdex-200 prep grade层析等方法纯化,获得了电泳纯的杂优-2平菇漆酶,并对纯化的漆酶进行了部分酶学性质研究。结果显示,杂优-2平菇漆酶比活力为115 U/mg,分子质量约为244.0 kD,亚基分子质量约为85.6 kD。最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55 ℃,在pH 6.0～8.0及40～55 ℃范围内稳定性较好;最适条件下,以2,2’-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）为底物的Km值为2.1 mmol/L,最大反应速率（vmax）为0.117 μmol/（min·L）。Fe2＋、抗坏血酸对该酶活性具有完全抑制作用,乙二胺四乙酸、Ag＋、Mg2＋、Li＋对该酶活性影响较小;草酸、甲醇、正丁醇、K＋、Ca2＋、Ba2＋、Zn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Mn2＋、Co2＋对该酶活性有不同程度的抑制作用;Cu2＋激活作用不明显;尿素、乙醇、异丙醇对该酶活性具有激活作用。     

牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及部分酶学性质

取新鲜牛肝,经匀浆、缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等方法纯化,获得了电泳纯的牛肝谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）。经过纯化后的结果：GDH的酶比活力为306.06 U/mg,纯化倍数为93.60 倍,酶活回收率为23.12%。GDH的分子质量为380.2 kD,亚基分子质量约为61.7 kD。酶学性质研究结果表明：GDH的最适反应温度为50 ℃,在温度为30 ℃以下时较稳定;最适反应pH值为8.2,该酶对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的Km值为0.696 mmol/L。甲醇、乙醇、异丙醇、Cd2+、Co2+、Ca2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+对该酶具有抑制作用,低浓度Ba2+、Mg2+、K+、Li+与乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）对其具有一定的激活作用。     

产β-葡萄糖苷酶真菌的筛选鉴定、纯化及酶学性质分析

经刚果红平板染色法从土样中筛选到3株产纤维素酶的真菌,通过对其β-葡萄糖苷酶活力的测定,选择一株相对活力较高的菌株进行菌种鉴定。在形态鉴定的基础上,通过内转录间隔区(ITS)序列构建系统发育树初步鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae),命名为giF-10。对米曲霉giF-10进行摇瓶发酵,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE Cellulose 52离子交换层析进行纯化。得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,比活力为40.84U/mg,分子质量约90kD;该β-葡萄糖苷酶最适温度为55℃;在30～50℃之间热稳定性好;最适pH值为4.5;pH4.0～6.0稳定性好;金属离子对酶活力具有一定的影响,Mn2+对酶具有较强的激活作用;Fe3+和Cu2+对β-葡萄糖苷酶活力有较强的抑制作用;该酶对水杨素和纤维二糖具有较强的底物特异性;β-葡萄糖苷酶对水杨素的动力学参数：Km为0.676mmol/L;对纤维二糖的动力学参数为：Km为2.906mmol/L。     

猪背最长肌焦磷酸酶的分离纯化与酶学特性

通过离心、50%～70%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换柱层析,从猪背最长肌中分离纯化出焦磷酸酶(PPase)。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,PPase分子质量约72kD。焦磷酸酶酶学特性研究表明,最适反应温度和pH值分别为50℃和7.5。Mg2+是PPase的激活剂,在浓度4.75mmol/L时,酶活力最强。但Na+和K+都能抑制酶的活力,且Na+的抑制效果强于K+。PPase水解焦磷酸钠(TSPP)的动力学参数Vmax为0.086μmol/(L.min)),Km为0.36mmol/L。     

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1 622.33 U/mg,回收率为29.05%,纯化倍数为34.58;该酶分子质量约为171.79 kD,亚基分子质量约为43.68 kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45 ℃和10.0;在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范围内稳定性较好;最适条件下测得该酶对乙醇的Km值为19 mmol/L;正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn2＋、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Mg2＋对该酶有激活作用,EDTA对该酶有双重作用。     

韦伯灵芝漆酶的分离纯化及其性质

采用硫酸铵分级盐析、透析、聚乙二醇浓缩和高效液相色谱柱层析从韦伯灵芝TZC-1 发酵液中分离纯化得到电泳纯漆酶,其纯化倍数为37.1 倍,酶活性回收率为21.3%。活性-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果表明该漆酶由一种同工酶组成,纯化漆酶经SDS-PAGE 检测显示为单一条带,其分子质量约为40kD。该漆酶催化底物ABTS 的最适反应温度为50～60℃,最适反应pH 值为4.6,在60℃以下和pH3.0～5.0 范围内保持稳定,以ABTS为底物的表观Km 值为13.8μmol/L。Fe2+ 完全抑制酶活,Al3+ 和Mn2+ 对该漆酶也有明显抑制作用,Hg+、Cu2+ 和Mg2+ 对该酶有明显激活作用,而Zn2+、Ba2+ 及K+ 对该酶活性影响不大。