雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究

采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因(rnl),将其连接到pPICZαA载体上,得到重组表达载体pPICZαA-rnl。将表达载体pPICZαA-rnl用限制性内切酶SacI线性化后,电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达,重组菌株摇瓶培养144 h后,酶活可达48 U/mL。重组酶最适pH值为8.5,最适反应温度为35℃。1 mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性剂吐温20,吐温80,曲通100对重组脂肪酶具有激活作用。重组酶的最适底物为三月桂酸甘油酯(C12)。     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。     

抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。     

优化毕赤酵母X33重组表达球形马拉色菌脂肪酶LIP1

研究人工合成球形马拉色菌脂肪酶LIP1的基因,并成功在毕赤酵母X33中重组表达.利用响应面分析法,构建LIP1的酶活回归方程.由响应面分析,在温度27.0℃,pH值为7.69,酵母提取物浓度1.50％和葡萄糖浓度3.37％时,预测最大酶活为33U/mL.通过实验验证,最后结果为38U/mL.该值与模型预测基本一致.优化后的酶活提高了26.67％.通过响应面的条件优化,可以获得毕赤酵母X33重组表达LIP1的最大酶活.     

米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

重组嗜热乳糖酶在毕赤酵母中的表达、纯化与活性分析

为获得耐高温的重组乳糖酶,PCR扩增激烈热球菌(Pyrococcus furious)乳糖酶基因、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/Lac并转化毕赤酵母X-33菌株。重组酵母转化子经甲醇诱导,重组嗜热乳糖酶实现了分泌表达并经蛋白印迹验证。纯化前上清液中乳糖酶总活力高达125 U/mL,经镍亲合纯化得重组酶,SDS-PAGE显示其纯度在95%以上,比活力1 800 U/mg,该酶最适温度在105℃左右且热稳定性好,具有很强的水解乳糖能力。     

角毛壳菌木聚糖酶基因xyn24在毕赤酵母中的高效表达及产酶的固定化研究

以生防真菌角毛壳菌(Chaetomium cupreum)菌丝体时期的基因文库为基础,筛选得到编码木聚糖酶基因的片段,经拼接及RT-PCR扩增得到全长690bp的编码β-1,4-木聚糖酶基因序列,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达的木聚糖酶重组载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,表达蛋白分泌到培养基中,分子质量约为19.4 ku;以水溶性壳聚糖为底物测得酶活为2.72 U/mL。SDS及金属离子Mn2+对酶活性具有较强的激活作用;转化子经10代传代培养后酶活性稳定。通过制备的壳聚糖微球对木聚糖酶进行了固定化研究,并与游离酶的性质进行了比较。结果表明:固定化酶的最适pH范围与游离酶相比向酸性方向偏移;固定化酶的最适反应温度、酸碱稳定性及热稳定性均有所提高。     

短小芽孢杆菌碱性β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以毕赤酵母密码子为基准,对短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因密码子进行优化,设计合成全基因序列,构建表达载体转入毕赤酵母中。结果表明,短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因已成功转入酵母菌中并分泌表达,诱导培养72h发酵液的酶活力可达25.39U/mL。重组酶最适反应温度45℃,最适pH 9.0,重组酶的K_m值1.26mmol/L,V_(max)为32.15μmol/(min·mg)。重组β-葡萄糖苷酶对大豆苷水解活性相对活力是pNPG的248%,转糖苷活性催化50%底物葡萄糖合成龙胆二糖,达34.25g/L。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中。本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经SacI线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku。β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃。      

密码子优化及透明颤菌血红蛋白共表达提高耐热脂肪酶在毕赤酵母的表达

根据毕赤酵母密码子的偏好性,通过在线软件对Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb）进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因（tll-opt）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）中碱基GC含量分别由原来的46%提高到49%和42%提高到51%,碱基A、T、C、G均匀分布,减少了AT和GC富集区,利于tll-opt和vhb-opt基因在毕赤酵母X33中的表达。将tll和tll-opt连接到表达载体pPICZαA并转入毕赤酵母X33中。摇瓶培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为7 U/mL和16 U/mL。50 L发酵罐培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为201 U/mL和430 U/mL。为了进一步提高含tll-opt重组工程菌的表达酶活性,将vhb-opt转入该重组工程菌得到工程菌VHb＋（含有tll-opt和vhb-opt）。重组工程菌VHb＋在摇瓶培养条件下最大酶活力为23 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.39 倍和3.28 倍。重组工程菌VHb＋在50 L发酵罐瓶培养条件下最大酶活力为610 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.41 倍和3.03 倍。     

门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的克隆及其在酵母中的表达

采用同源克隆法获得了门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的全长序列,DNA测序结果表明,该基因的DNA全长序列为801bp,编码267个氨基酸,推测蛋白相对分子量为29.95ku。将该脂肪酶基因连接到pPICZαA载体上得到重组表达质粒,转化Pichia pastoris X-33。脂肪酶基因在Pichia pastoris X-33中实现了分泌性表达,摇瓶发酵液上清酶活最大可达8U/mL。      

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶北大核心CSCD

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。     

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为：28 ℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S. aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）为10 μg/mL。     

N-糖基化对重组木聚糖酶XynA酶学特性的影响

为实现木聚糖酶的高效表达,扩大实际生产应用,本实验将木聚糖酶基因xynA在毕赤酵母中进行重组表达,同时采用糖基化抑制剂衣霉素处理毕赤酵母细胞,以此来探讨N-糖基化对木聚糖酶XynA酶学性质的影响。结果表明,SDS-PAGE电泳图谱显示木聚糖酶XynA发生了N-糖基化修饰,分子量约为45 kDa,酶活为406.6 U/mL,最适pH及反应温度分别为5.0和65 ℃;而添加不同浓度衣霉素处理后的木聚糖酶最适pH不变,最适反应温度下降5 ℃,随着衣霉素浓度的增加,去糖基化的木聚糖酶酶活力、分泌量及温度稳定性均有所下降,且当衣霉素添加浓度为15 μg/mL时,剩余酶活为53.6%。去糖基化的木聚糖酶耐受胃蛋白酶的能力较糖基化的有所增强,Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA相对于糖基化的木聚糖酶表现出了一定的激活作用。以上结果说明N-糖基化作为一种重要的翻译后修饰对木聚糖酶XynA的分泌及热稳定性有促进作用。     

串珠镰孢菌来源的角质酶基因的克隆表达及其酶学性质

克隆一个来源于串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme Sheld)的角质酶基因,该基因全长693 bp,编码231个成熟的氨基酸。克隆的角质酶基因构建到pPIC9K质粒,获得重组表达载体,转入毕赤酵母(Pichia pastoris Gs115)中进行高效表达。经甲醇诱导96 h,测得重组酶酶活为71.68 U/mL,经纯化获得比活力为2490.1 U/mg。对纯化后的角质酶进行酶学性质分析结果表明,其最适反应pH为9.0,在pH5.0~9.0范围内之间重组角质酶的酶活相对稳定;最适反应温度为35 ℃,在40 ℃条件下保温1 h酶活力保持70%以上。KCl、Triton X-100、MnCl₂、SDS对该酶活有促进作用,NaCl、BaCl₂、CuSO₄、Tween-20、FeSO₄、ZnSO₄、NiCl₂、EDTA、Tween-80对该酶活有抑制作用。