高产二十碳五烯酸的微拟球藻藻株的诱变选育

二十碳五烯酸(C20∶5,n-3,EPA),是一种ω-3多不饱和脂肪酸,具有广泛的生物活性.目前,微拟球藻(Nannochloropsis)被认为是最有潜力的EPA的生产藻株而被广泛关注.针对微拟球藻野生藻株进行了重离子束辐照联合三氯生诱变选育,以期获得高产EPA的微拟球藻藻株.最终获得的突变株M44,其EPA质量分数为43.3%,EPA质量浓度达到2.5g/L,是出发藻株的2.38倍.本研究证实了一种可用于改良EPA生产的诱变育种策略,并提供了一种具有较高EPA产量的微拟球藻突变藻株.     

二十碳五烯酸高产菌株的诱变选育及柠檬酸对其油脂合成的影响

利用UV-LiCl复合诱变腐霉出发菌株,通过低温培养和苏丹Ⅱ染色镜检初筛、摇瓶发酵复筛,获得1株二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)高产菌株腐霉H6,经20℃-15℃二阶段培养168 h,所得生物量、油脂含量和EPA含量分别为23.50 g/L、17.54%和15.36%,EPA产量为633.17 mg/L,较出发菌株(263.80 mg/L)提高了140.02%,且产量、性状稳定。添加不同浓度柠檬酸对腐霉H6油脂合成调控的研究表明,发酵中期添加1.5 g/L柠檬酸可显著增加葡萄糖的利用率,提高油脂含量和EPA含量,EPA产量达890.49 mg/L,与对照相比提高40.64%。发酵实验表明腐霉H6极有潜力开发成为工业化生产菌种。     

培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和EPA产率的影响

眼点拟微绿球藻(N.oculata)具有生长速度快、含油量高等优点,且其脂肪酸组成中含有大量二十碳五烯酸(EPA),因此它是微藻生物柴油的良好原料。以眼点拟微绿球藻为对象,研究了培养时间、盐度、pH值等培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和EPA产率的影响。试验表明:选择稳定5 d为眼点拟微绿球藻的最佳采收时间,油脂含量为378.1 mg/g干藻,EPA产率为5.5 mg/(L·d);当盐度为16.7时,眼点拟微绿球藻的油脂含量和EPA产率均能达到最高,油脂含量为506.0 mg/g干藻,EPA产率为7.37 mg/(L·d);在适合眼点拟微绿球藻生长的pH值(8.0~10.0)下,保持整个培养过程中pH值为8.0,油脂含量和EPA产率均较高,油脂含量为471.7 mg/g干藻,EPA产率为7.45 mg/(L·d)。     

溶剂法提取微拟球藻脂质的工艺优化及其脂质组学分析

研究了溶剂法提取微拟球藻脂质的工艺,对比了氯仿-甲醇（体积比1∶?1）、氯仿、异丙醇、石油醚、正己烷-乙醇（体积比1∶?1）、正己烷、乙醇7种溶剂对微拟球藻脂质得率和二十碳五烯酸（EPA）含量的影响,确定乙醇作为提取溶剂。采用单因素试验研究了乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间对微拟球藻脂质提取的影响,并通过正交试验对工艺条件进行优化,最后采用UPLC-Q-TOF-MS对所得微拟球藻脂质进行脂质组学分析。结果表明,微拟球藻脂质最佳提取工艺条件为乙醇体积分数80%、料液比1∶?17.5、提取温度65?℃、提取时间2 h。在最佳工艺条件下,微拟球藻脂质得率为（1587±0.21）%,EPA含量为（14.49±0.14）g/100 g。微拟球藻脂质中检出17种脂质,其中12种脂质含有EPA,含有EPA的脂质占总脂质的45.24%。     

提高微绿球藻的生物量和油脂含量的研究

研究光照强度和硝酸钾质量浓度对微绿球藻生物量和油脂含量的影响,通过两步培养法培养微绿球藻提高其生物量和油脂含量。结果表明:在硝酸钾质量浓度100 mg/L条件下,当光照强度为1 940~2 060 lx时,培养12 d,微绿球藻的生物量和油脂含量最高,分别为0.68 g/L和16.28%;低光照强度(1 940~2 060 lx)下,在不添加硝酸钾时,微绿球藻的生物量最低,为0.39 g/L,油脂含量最高,为22.62%;随着硝酸钾质量浓度的增加,微绿球藻的生物量逐渐增加,而油脂含量逐渐下降;两步培养法可以促进微绿球藻的油脂合成,油脂含量和油脂产量分别达到30.50%和0.15 g/L。     

尼罗红染色荧光定量海洋微拟球藻胞内油脂含量

以海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica为受试对象,采用尼罗红染色荧光定量胞内油脂含量。采用单因素实验考察了激发波长、发射波长、二甲基亚砜体积分数、染色时间、尼罗红质量浓度对微藻胞内油脂荧光强度的影响,在此基础上,采用响应面实验进行染色荧光定量条件优化。结果表明,优化的微拟球藻胞内油脂尼罗红染色荧光定量最佳条件为二甲基亚砜体积分数25.6%、染色时间16 min、尼罗红质量浓度0.11 μg/mL、激发波长430 nm、发射波长685 nm。在最佳条件下,尼罗红染色微拟球藻胞内油脂荧光强度与油脂含量显著正相关（R2=0999 9）,说明通过尼罗红染色荧光法可快速表征微拟球藻胞内油脂含量。研究结果为后续微拟球藻资源高值化应用及高产油脂海洋微藻快速筛选和动态追踪微藻产油过程提供了依据。     

氮源对 Nannochloropsis oculata生化组成、超微结构及生产的影响

为了提高眼点微拟球藻生物量及生产强度,比较了氯化铵、乙酸铵及硝酸钠三种氮源对其生理生化及生产的影响。结果显示:铵盐组胞内蛋白质质量分数高于硝酸钠组,叶绿素a质量分数结果相反;乙酸铵组总油质量分数最高,为13.5%;硝酸钠组总碳水化合物质量分数最高,为16.5%。硝酸钠组极性油/中性油比值及EPA相对含量最高,分别为5.9和26.6%。铵盐组藻细胞尺寸大于硝酸钠组;硝酸钠组叶绿体数量、相对体积、类囊体密度高于铵盐组;仅乙酸铵组胞内含有油体。乙酸铵组生物量及生产强度最大,分别为873 mg/L和25.3 mg/(L·d)。     

微拟球藻脂质的亚临界提取工艺优化及其成分分析

采用亚临界丁烷提取微拟球藻脂质。在单因素试验的基础上采用正交试验对影响微拟球藻脂质提取率的因素进行优化,并测定了微拟球藻脂质的酸价、过氧化值、碘值、磷脂含量、脂肪组成以及脂肪酸组成。结果表明:亚临界丁烷提取微拟球藻脂质的最佳工艺条件为单次提取时间40 min、提取4次、提取温度45℃、料液比1∶8,在此条件下微拟球藻脂质提取率为41. 55%;提取的微拟球藻脂质呈深绿色油性糊状,其酸价(KOH) 20. 4 mg/g,过氧化值0. 001 g/100 g,碘值(I) 86. 0g/100 g,磷脂含量107. 28 mg/g;微拟球藻脂质中总脂肪含量为40. 22%,脂肪酸组成主要以不饱和脂肪酸为主,其中EPA含量为7. 21%。     

添加氮源和金属离子提高深黄伞形霉利用麸皮水解液积累油脂的研究

深黄伞形霉是积累油脂的重要微生物,以深黄伞形霉利用麸皮水解液生成油脂有利于麸皮的综合利用。基于前期研究,在麸皮水解液中添加氮源、金属离子提高了油脂产量和麸皮水解液中糖分的利用。当乙酸铵添加至氮元素为1.5 g/L时,深黄伞形霉的生物量达到最大值25.8 g/L。乙酸铵添加至氮元素为1.0 g/L时,油脂产量提高11%。麸皮水解液中添加Mg²⁺、Ca²⁺和Mn²⁺促进深黄伞形霉的代谢和脂肪合成。当添加0.5 g/L CaCl₂、1.0 g/L MgSO₄、8μg/L MnSO₄时油脂产量分别提高脂肪酸分别达到13.8、10.26、12.91 g/L,分别提高了39.8%、65.8%、30.8%。研究结果为麸皮的综合利用提供了参考。     

硝态氮对Nannochloropsis oculata生长及合成胞内组分的影响

研究了硝态氮对Nannochloropsis oculata C170细胞生长及胞内组分合成的影响。以硝酸钠为氮源考察不同氮浓度下藻细胞生长、氮消耗及油脂含量变化,并在此基础上分析氮限制处理时油脂、总糖及蛋白等胞内组分合成差异。结果表明:N.oculata C170在42.5mg/L氮浓度时生长最佳,其生物量、比生长速率及产率最高,分别为0.59g/L、0.275d-1和50.98mg/(L·d)。油脂含量与氮浓度呈明显负相关,氮浓度为12.5mg/L时,油脂含量和产率最高,分别为29.17%和11.40mg/(L·d)。而胞内多不饱和脂肪酸比例随着氮浓度的升高显著增加,其中EPA含量由8.06%升高到18.76%。此外藻细胞在限氮培养时,其油脂含量增加至23.07%,为最初含量的2.8倍,同时总糖含量升高了76%左右,叶绿素a和蛋白含量则分别下降了大约29%和24%。高浓度硝态氮有利于N.oculata C170细胞生长及胞内EPA积累,低浓度硝态氮诱导藻细胞油脂积累并与糖类合成、色素和蛋白降解相关联。     

不同前体物质的添加对高山被孢霉生长及脂肪酸组分的影响

通过添加植物油及吐温作为高山被孢霉合成油脂的前体物质,分别考察了不同前体物质的添加对菌体的生物量、油脂含量、油脂产量及所得油脂中各脂肪酸组分的影响。实验结果显示:添加植物油作为前体不但可以提高菌体中油脂含量,而且会使油脂中花生四烯酸的产量得到大幅度提高,其中加入菜籽油、亚麻籽油及大豆油为前体时,花生四烯酸的产量分别达到了2 063.2、2 062.8 mg/L及2 192.9 mg/L,比对照组提高了112.72%、112.68%及126.10%;而以吐温80为前体时,虽然菌体的油脂产量有所降低,但油脂中花生四烯酸的产量比对照组提高了79.91%,达到了1 744.9 mg/L。     

产油脂海洋微藻的筛选、鉴定及Fe3+对其生长和油脂积累的影响

采用尼罗红染色和油脂提取相结合的方法,从105株海洋微藻中,筛选并鉴定了1株油脂产量较高的微藻琴式菱形藻(Psammodictyon panduriforme),研究了Fe3+对其生长和油脂积累的影响.结果表明,添加Fe3+有利于Psammodictyon panduriforme的生长和油脂积累,在Fe3+浓度为4×10-4mol/L时,其生物量最大(0.65 g/L),油脂含量最高(49.07％),此时的油脂产量也最高,达到了318.96 mg/L,是不加Fe3+培养的6.15倍.     

锌、锰对微拟球藻生长及营养物质积累的影响

研究了不同质量浓度锌锰共同添加对微拟球藻（Nannochloropsis oculata）生长及营养物质积累的影响,结果表明,不同质量浓度的锌锰胁迫对培养液中藻细胞密度的影响和单个藻细胞中营养物质的积累不同。当培养液中Zn2+质量浓度为60 μg/L,Mn2+质量浓度为400 μg/L时,藻细胞密度、蛋白质和粗脂肪含量最高,分别为8.5×108个/mL、0.59 mg/mL和0.71 mg/mL。当培养液中Zn2+、Mn2+质量浓度分别为40 μg/L和600 μg/L时,藻细胞密度为6.2×108个/mL,单个藻细胞中蛋白质含量和粗脂肪含量最高,分别为0.98×10-9 mg和1.83×10-9 mg。     

优化鸡粪微生态分解及添加降解液促进微藻过量合成生物油脂

以小球藻(Chlorella protothecoides)为出发菌株,优化鸡粪微生态分解及添加降解液促进微藻细胞生长和胞内油脂合成。通过控制溶解氧(DO)优化鸡粪微生态分解,获得高氮和低氮两种降解液。微藻培养过程分为细胞生长(0~120 h)和油脂合成(120~200 h)两个阶段,前期添加高氮降解液促进细胞生长,后期添加低氮降解液和葡萄糖补充氮源及能量过量合成油脂,实现细胞浓度和生物油脂产率最大化。C.protothecoides培养期间,0~120 h恒速流加(15 m L/(L·D))高氮降解液,120~200 h流加(15 m L/(L·D))低氮降解液和葡萄糖(1.5 g/(L·D)),培养结束(200h)时,油脂质量浓度高达5.28 g/L,分别比对照及不添加葡萄糖时油脂质量浓度增加74.8%和21.1%。结果表明,两阶段鸡粪降解液添加与葡萄糖再生ATP结合策略促进油脂合成是有效的。     

水杨酸诱导对斜生栅藻生长及油脂积累的影响

为缓解化石能源压力,提高生物质能源的使用率,以空气中CO₂作为自养培养斜生栅藻的碳源,添加植物激素水杨酸(SA)诱导斜生栅藻,研究斜生栅藻细胞密度、叶绿素a含量、油脂含量及产率等的变化情况,探讨在SA诱导下斜生栅藻的产脂机制。结果表明：培养16 d, SA对斜生栅藻生长及油脂积累表现出显著促进效果,当SA质量浓度为20 mg/L时,细胞密度最大,为(1.89±0.06)g/L,较对照组提高了34.47%;在实验范围内(SA质量浓度0～40 mg/L),油脂产率与SA质量浓度呈线性正相关;油脂含量及产率均在SA质量浓度为40 mg/L时达到最大,分别为(48.49±7.47)%和(22.35±3.77)mg/(L·d),较对照组分别提高了72.85%和1.43倍;SA对斜生栅藻细胞官能团中的酯基、羧基、磷酸基团等产生了影响;同时,在SA诱导下斜生栅藻的油脂代谢途径与叶绿素、酶、抗逆性等因素有关。综上,SA既提高了斜生栅藻的生物量,又促进了其光合作用和储能物质转化,提高了油脂产率。     

氮、磷源及海盐对微茫藻细胞生长和油脂积累的影响

为研究营养成分对一株淡水富油微茫藻(Micractinium reisseri)细胞生长和油脂积累的影响.以BG11为基础培养基,分别考察了氮源、磷浓度及海盐浓度的影响.实验结果表明,氯化铵为微茫藻细胞生长和油脂积累的最适氮源,以其为氮源时,微茫藻的油脂产量是原培养基中以硝酸钠为氮源时的1.6倍,缺氮培养条件下,微茫藻细胞油脂含量最高,但生物量较低;培养基中的磷浓度为80mg/L时,微茫藻总脂产量达到最高,为原培养基中磷浓度(40mg/L)时的1.4倍;添加适量海盐能够促进微茫藻的生长,同时该株微茫藻可以耐受比较高的海盐浓度(20g/L),其最适生长和油脂积累的海盐浓度为10g/L,在此浓度下,其总脂产量最高,是未添加海盐时的2.5倍.     

维生素对大肠杆菌Escherichia coli.JN8产L-色氨酸的影响

研究了9种维生素对大肠杆菌Escherichia coli.JN8生长及其发酵产L-色氨酸产量的影响,并对发酵培养基中的维生素浓度进行了优化。结果表明,低浓度肌醇和叶酸可显著促进大肠杆菌的生长及L-色氨酸的合成,叶酸和肌醇的最适添加量分别为0.000 2 mg/L和0.2 mg/L;较高浓度的生物素可以明显促进菌体生长及色氨酸的合成,其最适添加量为0.12 mg/L;较低浓度VB6的添加严重抑制色氨酸的合成,当其质量浓度增至0.8 mg/L时,菌体浓度和色氨酸的产量均较对照有显著的提高,分别提高11.8%和27.2%。添加VB5可略微提高色氨酸的产量,最优质量浓度为0.4 mg/L。添加VB1、VB2、VB3和VC虽然对菌体的生长均有较强的促进作用,但对于色氨酸合成却有不同程度的抑制作用。     

利用发酵促进剂提高红酵母β-胡萝卜素产率

为提高红酵母生物合成β-胡萝卜素的产量,分别研究了几种添加物对发酵过程的促进效应。试验结果表明:分别添加硫胺素、核黄素、大豆油和番茄汁可以显著促进红酵母合成β-胡萝卜素。当按单因素试验确定的最优添加量联合添加硫胺素1.5mg/L、核黄素3mg/L、大豆油5mg/L、番茄汁6mg/L时,试验证实β-胡萝卜素发酵产率可比对照提高80%以上,值得进一步研究。     

金属离子对斯达油脂酵母发酵产油脂的影响

通过摇瓶培养考察金属离子(Mg2+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Cu2+)对斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi 1809)生长和发酵生产油脂的影响。结果表明:在不同金属离子的各种浓度下,斯达油脂酵母的菌体生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数的差异均达到极显著水平(P0.01)。当培养基中缺失Mg2+或Fe3+或Zn2+时明显抑制菌体生长和油脂积累,添加适当浓度的Mg2+、Fe3+、Zn2+可促进斯达油脂酵母菌体生长和油脂合成,菌体利用底物合成油脂的转化率显著提高;添加适当浓度的Ca2+或Cu2+有利于菌体生长和油脂积累;Mn2+缺失有利于菌体生长和油脂合成,Mn2+浓度越高越不利于油脂积累。在试验浓度范围,MgSO4.7H2O 1 000 mg/L、CaCl2.2H2O 500 mg/L、FeCl3.6 H2O 1.6 mg/L、ZnSO4.7H2O 0.3 mg/L、MnCl2.4H2O 0.008 mg/L、CuCl2.2H2O 0.08 mg/L为斯达油脂酵母生长和油脂积累的适宜浓度。结论:在培养基C/N一定的条件下,金属离子对斯达油脂酵母生长和产油脂能力起着重要的作用,本试验结果对建立微生物油脂发酵调控的新策略具有重要的理论和实践意义。     

植物激素及维生素对微藻GN6生长及油脂产量的影响研究

以自行筛选的微藻GN6为试验菌种,首先研究海绿素、复硝酚钠、吲哚乙酸3种植物激素及维生素B1和维生素B12两种维生素对微藻生长及油脂产量的影响,然后在上述单因素试验研究结果基础上进行了四因素三水平的正交试验优化。结果表明:微藻GN6以BG11为基础培养基的最佳培养条件为1.5 m L/L海绿素、15μg/L维生素B12、0.60 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖;将优化后的培养条件和未优化的培养条件进行比较,结果发现在最优条件下微藻GN6的生物量及油脂产量分别为16.4 g/L和1.62 g/L,与未优化相比分别提高了100.3%和52.2%。试验为通过添加植物激素或维生素提高产油脂微藻的生长及产油脂能力提供了有益的探索。