马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bp)设计合成了两对引物,通过RT-PCR扩增得到长0.7bp的目的片段.将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVX分离物CP基因序列比较,发现其核苷酸同源性最高可达99%左右,证明此病毒为PVX.构建了含PVXCP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定该融合蛋白GST-XCP的相对分子质量为52000.Westemblot分析结果显示,GST-XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应,表明GST-XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性.制备了GST-XCP抗血清,并利用此抗血清建立了PVX的间接ELISA检测方法,检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片.     

转录因子AP-2α与TES蛋白相互作用分析

为研究转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用机制,分别构建AP-2α与GST的融合蛋白原核表达载体及TES与His的融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌E.coli BL 21中诱导表达,表达产物经纯化后用GST Pull-down及免疫印迹技术分析其相互作用关系.实验结果表明,AP-2α与TES之间存在相互作用是由于AP-2αC端能与TES C端的首个LIM结构域结合,酵母双杂交实验也证实了该结果;同时根据AP-2α只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提出了TES蛋白存在自身相互作用的可能,这种自身折叠封闭了位于TES C端首个LIM结构域上的AP-2α结合位点.     

牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆

根据牛γ-干扰素(bouIFN-γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段，将RT—PCR产物克隆到pMD18-T载体中，经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN-γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中，将pGEX-4T-1／bouIFN-γ转化到大肠杆菌中DH5a中。     

昆虫杆状病毒表达egfp载体构建及鉴定

用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ将目的基因片段6His-11R-eGFP从载体pDC316-6His-11R-eGFP上酶切下来,并将该目的基因片段与供体载体pFastBacl连接构建供体质粒pFastBacl-6His-11R-eGFP;将其转化大肠杆菌(Escherichua coli)DH10Bac感受态细胞,经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBac-6His-11R-eGFP,PCR鉴定得到单一目的基因条带.将该病毒载体转染Sf9细胞,进行病毒包装,在倒置荧光显微镜下观察蛋白表达,并以荧光定量PCR方法测定病毒滴度.     

CTB-InsB融合基因在大肠杆菌中的表达研究

构建了一种霍乱毒素B亚基（CTB）与人胰岛素B链（InsB）的融合基因，并克隆入表达载体pGEX-4T-1中，命名为pGEX—CTB-InsB。该融合蛋白在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在，分子量约为43kDa。包涵体经溶解和复性后，使用GSTrapFF亲和层析柱纯化得到融合蛋白。经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析证实纯化蛋白为重组目的蛋白。     

大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因的克隆表达、纯化及多抗血清的制备

RT-PCR克隆大豆主要过敏原Gly m Bd 28K基因,根据序列设计引物,扩增目的基因的开放阅读框,与MBP载体连接,测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,并用IPTG诱导表达.亲和层析法纯化重组蛋白,SDS-PAGE验证蛋白的纯度,免疫新西兰大白兔,收集多抗血清,用ELISA法测效价.扩增出含Gly m Bd 28K目的基因片段,诱导并获得高浓度和预期相符的表达产物,经层析纯化出Gly m Bd 28K蛋白,免疫新西兰大白兔,获得效价为1∶1.6×106多抗血清.     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25(217AA)和Pys48(455AA),以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的克隆与表达

参照GenBank中D—氨基酸氧化酶基因序列设计引物,利用跨内含子PCR技术从变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)基因组中扩增D—氨基酸氧化酶基因编码区序列。将DAAO基因用NcoⅠ和HindⅢ双酶切后,与经相同酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达变异三角酵母D—氨基酸氧化酶的工程菌株BL21(DE3)/pET-28a-DAAO。测序结果表明所克隆的基因序列与GenBank中变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因序列同源性达99%以上。SDS-PAGE分析及酶活测定表明所构建的工程菌能高效表达D—氨基酸氧化酶,且表达产物有较高酶活力。     

杂合抗菌肽MT在大肠杆菌中的融合表达

为了在大肠杆菌中表达杂合抗菌肽Magainin-Thanatin(MT).通过大肠杆菌密码子偏爱性优化两抗菌肽基因序列,SOE-PCR技术构建克隆载体并测序;将其转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中构建基因工程菌,表达产物做抑菌活性分析.结果在本研究中经SOE-PCR拼接后得到了杂合肽片段,成功构建了表达载体pGEX-6P-1-MT;转化后得到了重组菌株pGEX-6P-1-MT/BL21(DE3);获得诱导产物分子质量约3.35kDa;其对大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌等均有抑制作用.这表明杂合肽MT可以在大肠杆菌BL21(DE3)中融合分泌表达且具有抗菌活性.     

HCV e2-3pcx融合基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

构建了丙型肝炎病毒e2-3pcx融合基因的原核表达载体pET28b(+)-e2-3pcx,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。IPTG诱导融合蛋白高效表达。经SDS-PAGE电泳分析,结果表明在43 ku处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。     

SHP-2酪氨酸磷酸酶C—SH2结构域的表达纯化和NMR研究

SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶.将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2.该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%.质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同.在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构.     

携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆

利用依据黑曲霉β葡萄糖苷酶(bgl1)基因序列设计合成的一对特异性引物,以黑曲霉As3.350总DNA为模板,PCR扩增得到了预期大小的目的DNA片段,将该目的DNA片段转入大肠杆菌中并进行了序列测定。测序结果表明该DNA片段大小为2 948 bp,其核苷酸与β葡萄糖苷酶基因序列同源性达91%,该基因由7个外显子和6个内含子组成.     

自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测

为了提纯并鉴定自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体,探讨其在部分组织中的免疫定位．首先合成带谷胱甘肽转移酶标签的自噬基因融合蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗体浓度,最后用免疫亲和纯化方法提纯抗血清中的多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测抗体效价,蛋白印迹检测抗体特异性及在组织中的表达情况．结果表明：制备得到自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其质量浓度为每10μL含5μg,用酶联免疫吸附法显示此抗体效价及特异性较高,蛋白印迹显示蛋白大小为55kD左右．     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的28SrRNA和18SrRNA条带。根据PG37所产碱性脂肪酶（Lip PC）N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在3'端具有poly(A）等所提供的生物信息，采用RT－PCR技术扩增了Lip PC成熟肽和3'非编码区的cDNA片段，并将该PCR产物直接克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明，Lip PC含有258个氨基酸残基，其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用ClonTech公司的Smart^TM PCR cDNA文库构建试剂盒，扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段，从而完成了Lip PC完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中，SDSPAGE检测结果表明，大肠杆菌BL21所表达的GST－Lip PC融合蛋白质分子质量约为53ku。     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25（217AA）和Pys48（455AA）,以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因的原核表达

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒囊膜蛋白Gp64是杆状病毒感染宿主细胞的重要功能蛋白之一.通过Oligo6.0设计一对特异性引物,用于扩增Gp64基因的部分DNA片段,对聚合酶链式反应扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同尾酶双酶切后的原核表达载体p ET28a进行连接;对捕获有重组质粒p ET28a-Gp64的大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行异丙基硫代半乳糖苷诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;采用电透析的方法纯化了该蛋白,为进一步制备抗Gp64蛋白抗体做准备.     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.