氨基甲酸乙酯水解酶异源表达及酶学性质分析

将合成的来源于长孢洛德酵母菌（Lodderomyces elongisporus）属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力为9.86U/mg。酶学性质研究表明,氨基甲酸乙酯水解酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为7.0;金属离子Mg2+对该水解酶的酶活有微弱的促进作用,而Cu2+以及Fe3+对酶的活性有强烈的抑制作用;对低含量的乙醇溶液与NaCl溶液有一定的耐受性;并且该水解酶可以对不同底物的酰胺类化合物进行有效降解,以氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,EC）为底物进行反应时测得水解酶的动力学参数Km值为6.64 mmol/L,最大反应速率Vmax值为8.24 μmol/min。     

嗜酸乳杆菌胆盐水解酶的分离纯化及酶学性质

对嗜酸乳杆菌La-XH1产生的胆盐水解酶进行分离纯化,并对其部分酶学性质进行研究。结果表明：嗜酸乳杆菌La-XH1胆盐水解酶的粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B柱层析后的酶比活力分别为47.82 U/mg和115.85 U/mg,纯化倍数分别为4.46 倍和10.82 倍,酶的回收率分别为59.89%和25.11%;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）电泳分析,该酶的分子质量约为43 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6.0,Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对该酶有激活作用,其中Fe3+的激活作用最强,Na+、K+对该酶几乎无作用,而Cu2+、Ba2+对该酶有很强的抑制作用。     

假丝酵母氨基甲酸乙酯水解酶的分子克隆及酶学性质

氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物.生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯.该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达.实验结果表明,cpUH基因大小为1656 bp,编码552个氨基酸;重组蛋白大小约为60...     

梅奇酵母氨基甲酸乙酯酶分离纯化与酶学性质分析及其对葡萄酒香气的影响

为了研究梅奇酵母所产生氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,EC）酶的性质,通过硫酸铵盐析、离子交换层析的方法对EC酶进行分离纯化,并对纯化后EC酶的酶学性质进行了分析。结果表明,纯化后EC酶对比纯化前的酶活提高了约1.2倍。纯化后EC酶最适反应温度为35 ℃,在25~45 ℃之间热稳定性较强;最适pH为5.5,在pH5~6时该酶稳定性强,即酸稳定性强,碱稳定性较差。当乙醇体积分数为12%~14%时,EC酶具有一定酶活。底物特异性结果表明,该EC酶对EC及其前体物质（尿素）具有较高的降解能力,且对于成品葡萄酒挥发性香气成分影响不显著。     

环糊精葡萄糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究

通过筛选和诱变获得一株高产环糊精葡萄糖基转移酶芽孢杆菌菌株,研究该菌所产环糊精葡萄糖基转移酶的分离纯化及酶学性质,结果显示：发酵液经离心处理后,采用硫酸铵溶液分步盐析、DEAE-cellulose 52 离子交换层析、Sephadex G-200 凝胶过滤层析方法得到电泳级环糊精葡萄糖基转移酶,SDS-PAGE 电泳显示该酶分子量为33kD,纯化倍数为10,得率为14.4%。该酶反应的最适温度为50℃,在40～60℃基本稳定,最适pH 值为8.0,在pH6.0～10.0 范围内基本稳定。Fe2+、Cu2+、Mg2+ 对该酶活力有明显的抑制作用。     

海藻糖合成酶的分离纯化及部分酶学性质研究

食尼古丁节杆菌JNU-1（Arthrobacter nicotinovorus JNU-1）菌株所产胞内海藻糖合成酶，该酶能转化麦芽糖合成海藻糖，将食尼古丁节杆菌JNU-1进行大量的培养，富集发酵菌丝体，经超声破碎、浸提、离心后获得粗酶液，粗酶液经硫酸铵分级沉淀后，收集相应的活性部分，用葡聚糖凝胶进一步纯化，通过电泳来测定海藻糖合成酶的纯度和分子量。     

蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质测定

大蒜中功能成分含硫化合物是由蒜氨酸酶(alliinase,E C4.4.1.4)催化蒜氨酸(alliin)生成的。本实验通过提取、盐析、透析及层析,自新鲜大蒜中分离纯化出蒜氨酸酶,并测定了蒜氨酸酶的酶学性质。蒜氨酸酶的适宜分离纯化过程及条件为:pH7.0Na /K 磷酸缓冲液提取,45%饱和度NH4(SO4)2盐析,10000×g离心沉淀30min,pH6.5的Na /K 磷酸缓冲液溶解,截留1.4万分子量透析袋透析,Sephadex G-200层析,收集洗脱时间4.75h的洗脱液。蒜氨酸酶最适温度和pH值分别为30℃和6.3,Mg2 、Zn2 、Fe2 、Fe3 、EDTA-Na金属离子对蒜氨酸酶有激活作用,Fe3 激活作用最明显,Cu2 严重抑制蒜氨酸酶活性。以合成S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为5.91mmol/L、Vmax为1.55μmol/min。     

低温脂肪酶的分离纯化及酶学性质

苏云金芽胞杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为75.5倍,活性回收率为37.6%,12%SDS-PAGE电泳估计其相对分子质量约40 000。对纯化后的脂肪酶进行酶性质研究表明:酶的最适作用温度为25℃,对热敏感,60℃处理30 min仅残留30%酶活性;酶的适宜作用pH范围在7～9,最适pH为8;该脂肪酶的水解活性对Ca2+表现明显的依赖性,Al3+、Zn2+和Fe2+对脂肪酶有显著的抑制作用;脂肪酶对醇类有机溶剂的耐受性随碳链增加而减小;脂肪酶对豆油表现出显著的特异性,而蓖麻油抑制脂肪酶水解活力。     

巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究

巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,并对其性质进行研究。该酶比活力为54272.27U/mg,回收率为11.37%,纯化倍数为606.67倍。该酶分子质量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH值为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。     

可降解大豆过敏原蛋白酶的纯化与酶学性质

将前期筛选获得的芽孢杆菌Bacillus sp.BBE201108发酵培养后,以其发酵上清液作为蛋白酶的粗酶液,经硫酸铵分级沉淀、透析除盐、Q FF阴离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析,蛋白酶的比酶活达到2 575.45 U/mg,纯化倍数为10.55,回收率为6.48%,经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,该蛋白酶的表观相对分子质量约为46 000。该酶与大豆分离蛋白在p H8.0,50℃下反应30 min,可有效降解β-伴大豆球蛋白的α亚基和α'亚基。在p H 7.0~9.0以及30~40℃下的稳定较好;Ca2+存在的情况下,酶活提高了5%左右,而Mn2+、Fe2+和Cu2+在不同程度上对该蛋白酶有抑制作用;苯甲基磺酰氟(PMSF)对该蛋白酶的抑制作用较为显著。酶学性质分析表明,该蛋白酶的Km为4.19 g/L,Vmax为4.04 g/(L·s),Kcat为107.73 s-1,Kcat/Km为25.71 L/(g·s)。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺能够促进酶的活性,其中Ca²⁺激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析

采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,属于一种半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶的最适温度为50?℃;最适pH值为6.5;稳定温度为40?℃;稳定pH值为7.0;Mn2＋促进蛋白酶活力,Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、K＋、Na＋抑制蛋白酶活力,以上金属离子对蛋白酶二级结构也产生不同程度的影响;米氏常数Km为2.43?g/L,最大反应速率Vm为103.09?mg/（L·min）。在5、10?g/100?mL和15?g/100?mL的NaCl质量浓度条件下,蛋白酶保留的酶活力分别为77.22%、54.39%以及41.15%。该蛋白酶在高盐度环境下保持较高的酶活力,因此具有潜在的工业应用价值。     

芫荽酸性磷酸酶的提取、纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析法,从新鲜芫荽中分离纯化出电泳纯的酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）。该酶的酶活回收率为14.20%、纯化倍数为238.60、酶比活力为295.87 U/mg、亚基分子质量约为53.8 kD;芫荽ACP酶学性质研究结果表明：该酶的最适反应温度为55 ℃,在50 ℃以下时较稳定,因此该酶对温度较敏感;该酶的最适反应pH值为5.8,在pH?4.0～7.0之间较稳定,表明该酶耐受于酸性环境;芫荽ACP的对硝基苯酚磷酸二钠Km值为0.63 mmol/L,表明该酶与底物对硝基苯酚磷酸二钠具有较高的亲和力;甲醇、乙醇、异丙醇、抗坏血酸、草酸、Cu2＋、Pb2＋、Ag＋对该酶具有强烈的抑制作用;Mg2＋、Mn2＋、Ba2＋、K＋对该酶具有一定的激活作用。     

长双歧杆菌α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

对长双歧杆菌KLDS2.0509所分泌的α-半乳糖苷酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶的分子质量约为45 kD;酶学性质研究表明,该酶最适作用pH值为5.0,最适温度42 ℃;大多数金属离子对酶的活性无显著影响,Fe2+、Mn2+、Ag+和Cu2+能够对其产生抑制作用,而Hg2+完全抑制酶活性;该酶可降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。     

牛肾溶菌酶的分离纯化及部分酶学性质

将新鲜牛肾匀浆后,经由缓冲液提取,正丁醇除脂,硫酸铵分级沉淀,CM-Sepharose阳离子交换层析,Superdex-200凝胶过滤层析后得到电泳纯的牛肾溶菌酶。结果表明：该酶比活力为15 145.63 U/mg,回收率为29.13%,纯化倍数为231.05;分子质量约12.66 kD,为单亚基酶。最适反应温度为65 ℃,在65 ℃以下较稳定;最适pH 9.0,pH值在3.0～9.0范围内稳定性较好;测得最适条件下牛肾溶菌酶对溶壁微球菌的Km值为0.399 μg/mL;甲醇、乙醇、异丙醇和硫氰化钾（KSCN）对该酶有激活作用;十二烷基硫酸钠、Pb2＋、Ag＋对该酶有明显抑制作用。     

韭菜β-木糖苷酶的分离纯化与部分性质研究

新鲜韭菜经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、羧甲基离子交换层析(carboxymethyl-sephar ose,CMSepharose)再通过Su perdex-200凝胶过滤层析,从而获得电泳纯的β-木糖苷酶。该酶的比活力达到18.25 U/mg,纯化倍数为12.59,回收率为1.83%,分子质量为123.02 k D,亚基分子质量为61.51 k D。通过对β-木糖苷酶的酶学性质研究得到最适温度为65℃,最适p H值为4。该酶在25~55℃及p H 3.0~5.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其米氏常数(K_m)值为0.28 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和Ag+对该酶具有抑制作用,Mn~(2+)和Co~(2+)对该酶具有一定的激活作用。     

氨基甲酸乙酯降解酶的固定化研究

为了制备固定化酶,以体积分数5％的戊二醛溶液与壳聚糖交联8 h制备的载体对氨基甲酸乙酯(EC)降解酶粗酶液进行固定化,并对固定化EC降解酶的酶学性质展开分析.结果表明:固定化EC降解酶的最适温度和最适pH分别是42℃和3.6;该酶在乙醇体积分数7％～25％的范围内和使用次数在8次以内的酶活均保持在50％以上,说明该固定...