CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

米曲霉谷氨酰胺酶在黑曲霉中的重组表达与酶学特性

该研究将米曲霉RIB40（Aspergillus oryzae RIB40）来源的谷氨酰胺酶（GahB）在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中分泌表达。基于该研究所建立表型鉴定板与孔板培养的通量鉴定筛选方法成功得到重组表达谷氨酰胺酶的转化子H-GahB,最高酶活力达到1.35 U/mL。为了增加目的基因在宿主中的拷贝数,采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术重新构建高拷贝的谷氨酰胺酶表达菌株C-GahB,其酶活力提高到3.56 U/mL,约为H-GahB的2.64倍。进一步采用ARTP诱变技术对C-GahB进行传统诱变育种,获得了谷氨酰胺酶工程菌株A-GahB,其酶活力提升到4.16 U/mL,比出发菌株C-GahB的酶活力提高了0.17倍。纯化后的重组GahB的比酶活达到40.63 U/mg,最适温度为37 ℃,最适pH值为7.0,其在20~40 ℃及pH值5.5~8.0之间稳定性较好。K+对GahB的酶活力具有激活作用,Zn2+和Mn2+则对GahB的酶活力有较为强烈的抑制作用。当盐质量分数为18%时,GahB表现出35.38%的相对酶活力。该研究第一次在黑曲霉中实现了来源于米曲霉RIB40的谷氨酰胺酶GahB的重组分泌表达,为此后对米曲霉谷氨酰胺酶的研究提供了基础。     

酵母工程菌S.pombe yAS56的构建及魔芋红茶菌发酵工艺的研究

为研究利用魔芋精粉制备魔芋红茶菌的可行性,从约氏梭菌（Clostridium josui）中克隆β-葡聚糖酶基因cel9C,构建粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）重组表达质粒p ESP-2-2-cel9C,转化构建酵母工程菌,利用工程菌进行魔芋红茶菌发酵。采用析因实验设计和中心组合实验设计方法,以总酸为响应值,优化发酵条件,从7个因素中筛选出2个显著因素:装液量和时间。最佳条件为:绿茶0.4%、蔗糖7.5%、魔芋精粉0.25%、接种量10%、酿酒酵母/酵母工程菌接种细胞浓度比=0.5、装液量98.7 m L、时间124 h。在此条件下红茶菌总酸为（27.88±0.26）g/kg,与预测值相近,较优化前提高41.45%,表明利用魔芋精粉和酵母工程菌制备魔芋红茶菌具有可行性。      

基于CRISPR/Cas9系统的金针菇基因组编辑载体构建

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9,构建金针菇基因Mads-8敲除载体及转化体系。以转录组数据为依据,通过分析基因Mads-8序列信息,选择高效的靶位点序列,同时加入筛选标记基因hph构建过渡载体sgRNA-T,通过菌落PCR鉴定和测序来验证靶位点序列是否正确插入。以表达载体pg Fvs-cas9为框架,酶切连接后构建重组敲除载体pg Fvs-Cas9-gRNA,PCR和酶切鉴定敲除载体。再以PEG介导的金针菇原生质体转化表达载体,在潮霉素抗性平板上筛选拟转化子,以拟转化子基因组DNA为模板扩增Cas9基因。结果显示,靶位点序列成功插入敲除载体且序列正确,重组质粒成功转化进金针菇的基因组。对金针菇基因组敲除载体的构建,为后续金针菇相关基因的功能验证及育种研究提供载体材料及理论依据。      

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

基于细胞融合开发双基因共敲除技术

基因编码工具(例如CRISPR/Cas9)的出现使敲除哺乳动物细胞基因成为现实.然而,实现细胞的多基因敲除成功率低且所需时间长.细胞融合技术是构建杂合细胞的常用方法,通过融合两种不同表型的细胞,构建出一种具有杂合表型的新型细胞.但是,由于基因的互补作用,通过基因敲除而获得的性状在细胞融合后成为隐性性状,融合细胞不能表现...     

Physiological and biochemical analysis of cytochrome P-450 in the yeast Schizosaccharomyces pombe

The yeast Schizosacchromyces pombe has been shown to contain a microsomal cytochrome P-450 (cyt. P-450) inducible under conditions of glucose repression. Under these conditions the enzyme has maximal expression of 0.43 nmol g^?1 wet wt at the end of the exponential phase of growth. Substrate and inhibitor affinity was examined using studies of spectral changes on binding and revealed a type II spectrum with ketoconazole (K_s = 23 μM ) and a type I spectrum with benzo(a)pyrene (K_s = 77 μM ). A K_m of 112 μM was found in the aryl hydrocarbon hydroxylas assay. These properties show broad comparability with the cyt. P-450 of Saccharomyces cerevisiae.     

Transport of L-leucine in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe

Transport of L -leucine into Schizosaccharomyces pombe cells from the stationary phase of growth (after preincubation for 60 min with 1% glucose) proceeds uphill, practically unidirectionally, and is mediated by at least two systems: a high-affinity system with a K_T of 0·045 mmol 1^?1 and J_max of 3·3 nmol min^?1 (mg dry weight)^?1 and a low-affinity system with a K_T of 1·25 mmol 1^?1 and J_max of 16·0 nmol min^?1 (mg dry weight)^?1. The high-affinity system has a pH optimum at 3.2, the accumulation ratio is highest at a cell density of 2–4 mg dry weight per ml and decreases with increasing leucine concentration. Transport of leucine by the high-affinity system is strongly inhibited by proton conductors, ammonium ions and by most amino acids, but only L -phenylalanine, L -isoleucine, L -valine and L -cysteine behave as fully competitive inhibitors. Systems of L -leucine transport in S. pombe are not constitutive. Transport activity appears only after preincubation of cells with a suitable source of energy. If cycloheximide is added during preincubation with glucose, no transport systems for leucine are synthesized. After removal of glucose, the activity of transport systems decays with a half-time of about 20 min. The presence of cyclic AMP increases the initial rate of leucine uptake only in cells preincubated with glucose and in the absence of cycloheximide.     

利用粟酒裂殖酵母生长法定量测定肌醇浓度

利用本实验室分离得到的一株天然的肌醇合成缺陷型的粟酒裂殖酵母 (Schizosaccha romycespombe)特异地依赖外部肌醇生长的特性 ,研究了该菌株在含有不同浓度肌醇的合成培养基中的生长情况 ,发现在一定的肌醇浓度范围内 ,菌株的生物量随肌醇浓度增大而增大 ,且呈线性关系 ,由此建立了一套微生物法定量测定肌醇浓度的方法。我们发现在固定的培养温度、振荡速度等外部条件下 ,当接种量OD60 0 为 1 0、葡萄糖浓度为 4 0 %时 ,在肌醇浓度 0～ 5mg/L范围内 ,培养 52h后 ,肌醇测定标准曲线最为理想 ,R值为 0 9973。应用该方法对标准肌醇样品的测定得到了较好的结果