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相似文献
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1.
利用稀释平板法从米醋沉淀中分离获得细菌,通过对其进行16S rDNA分子鉴定,表明该细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。以该菌为实验材料,研究了细菌基因组DNA的提取方法,并将ERIC-PCR法首次应用于醋液菌种,对此反应体系的主要因素进行了优化,最终建立了适合于本实验室的ERIC-PCR体系。结果表明,采用改良的传统细菌基因组DNA提取方法,所提取的DNA质量较高,能够满足ERIC-PCR反应的需要;建立的反应体系为:25μL反应体积10×扩增缓冲液(含Mg2+)2.5μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E11.0μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E21.0μL,DNA模板2μL,2.5mmol/LdNTPs混合液1.6μL,taq聚合酶0.9μL,双蒸水补齐;PCR反应程序为:94℃变性4min,1个循环;94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸4min。  相似文献   

2.
利用稀释平板法从米醋沉淀中分离获得细菌,通过对其进行16S rDNA分子鉴定,表明该细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。以该菌为实验材料,研究了细菌基因组DNA的提取方法,并将ERIC-PCR法首次应用于醋液菌种,对此反应体系的主要因素进行了优化,最终建立了适合于本实验室的ERIC-PCR体系。结果表明,采用改良的传统细菌基因组DNA提取方法,所提取的DNA质量较高,能够满足ERIC-PCR反应的需要;建立的反应体系为:25μL反应体积10×扩增缓冲液(含Mg2+)2.5μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E11.0μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E21.0μL,DNA模板2μL,2.5mmol/LdNTPs混合液1.6μL,taq聚合酶0.9μL,双蒸水补齐;PCR反应程序为:94℃变性4min,1个循环;94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸4min。   相似文献   

3.
蜡样芽孢杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立   总被引:4,自引:4,他引:0       下载免费PDF全文
为建立简单快速的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)的分子分型方法,该研究以B.cereusCMCC 63303的基因组DNA为模板,并采用正交设计L16(45)对影响ERIC-PCR反应体系的五个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物)在四个浓度水平上进行优化,并通过单因素试验确定最佳退火温度,最后以优化后的反应体系对50株B.cereus分离株进行ERIC-PCR分子分型和聚类分析验证其稳定性和分型效果。结果显示应用建立的ERIC-PCR反应体系对50株分离株扩增均得到了9-17条、大小在200-4000 bp之间的条带,并可将其分为47个型,且分辨力达到0.996,具有较高稳定性和分辨能力。表明ERIC-PCR技术对B.cereus分型,具有简便和分辨力高等优点,可用于食源性B.cereus分离株的多样性研究。  相似文献   

4.
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是兼性需氧革兰氏阳性菌,为我国常见的食源性致病菌之一。基于PCR技术的快速检测方法在蜡样芽孢杆菌检测中已得到广泛运用,然而该菌在食品中多以芽孢形态存在,常规DNA提取方法难以得到高质量的DNA样本进行PCR反应。本文对鲜牛奶中蜡样芽孢杆菌芽孢进行溶菌酶法、煮沸法、液氮研磨法、超声波振荡法处理,再提取DNA比较PCR检测结果,实验表明,超声波振荡法能够有效的破碎芽孢细胞,提高DNA提取效率,增加PCR检测的灵敏度。  相似文献   

5.
6.
高温大曲中细菌总DNA提取方法比较   总被引:2,自引:0,他引:2  
研究了5种基于不同裂解机理的提取方法对高温大曲中总基因组提取效果的影响.结果表明,基于SDS-酶法裂解原理的提取方法获得的结果最优,此方法获得的总基因组片段大约为21 kb;纯度为:A260/A80=1.762,A260/A230=1.587;并且能不经纯化直接用于16S rDNA的扩增.为利用16S rDNA分析等后续一系列的分子生物学技术操作打好基础,使得利用先进的分子生物学技术对大曲微生物的研究成为可能.  相似文献   

7.
酒酒球菌基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化   总被引:2,自引:0,他引:2  
以酒酒球菌SD-2a为试验材料,研究了酒酒球菌基因组DNA的提取方法,对影响RAPD-PCR反应体系的主要因素进行了优化,最终建立了适合于本实验室的RAPD反应体系.结果表明,采用改良的传统细菌基因组DNA提取方法,所提取的DNA质量较高,能够满足RAPD反应的需要;建立的RAPD-PCR反应体系为:25μL反应体积、1.0 UTaq酶、160 μmol/L dNTP、0.4 μmol/L随机引物、3.0 mmol/L Mg2+、10 ng的DNA模板用量;PCR反应程序为:94℃变性300 s,1个循环;94℃变性60 s,36℃退火60 s,72℃延伸90 s,45个循环;72℃延伸300 s.  相似文献   

8.
烟草DNA的提取与SRAP反应体系的建立   总被引:37,自引:0,他引:37  
以10个烟草栽培品种为试验材料,研究了烟草DNA的提取方法以及对建立烟草SRAP-PCR反应体系的影响因子设置梯度实验,筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应条件:在25μL的反应体系中,MgCl22.0mmol、dNTP200μmol,上下引物各30ng、DNA模板40ng、DNA聚合酶1.5U,扩增程序为:在94℃预变性5min,反应前5个循环在94℃1min,33℃1min,72℃1min条件下运行;随后的30个循环复性温度提高到53℃,最后72℃延伸5min。本文还讨论了不同分子标记在烟草中应用的优缺点以及SRAP分子标记在烟草上的应用前景,提出了应用SRAP分子标记构建烟草遗传图谱的可行性。   相似文献   

9.
采用土壤DNA提取试剂盒和SDS-酶裂解法分别提取观音土曲的细菌DNA。基于SDS-酶法裂解原理的提取方法获得的结果比较理想,此方法获得的基因组片段大于15kb;A260/A280为1.82,A260/A230为1.54,DNA纯度很高;提取的DNA不经纯化能直接用于细菌16S rDNA的扩增。该法提取的DNA能直接用于后续的分子生物学实验操作。  相似文献   

10.
以14个不同地理来源的油莎豆品系为实验材料,研究了油莎豆DNA快速提取方法;以SRAP反应体系中DNA模板量、Mg2+浓度和引物浓度3个因子分别设置3个水平,共配制27个反应体系,对油莎豆SRAP反应体系进行优化。研究结果表明:改良CTAB法可获得较高质量的DNA,参试材料的A260/A280介于1.70~1.98;在27个SRAP反应体系(15μL)中,最优反应体系为DNA模板25ng、Mg2+1.5mmol/L、引物浓度1μmol/L、dNTPs 0.3mmol/L和Taq酶1U,可扩增出清晰稳定的多态性条带。  相似文献   

11.
12.
田敏  冯震  曲瑞丹  黄静  戚稼禹  曹杰 《食品工业科技》2020,41(1):105-111,118
目的:为了建立一种高效分离筛选高产蛋白质谷氨酰胺酶的解朊金黄杆菌的筛选方法,采用肠道基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)和全自动核糖体分型方法对来自不同环境的33株解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)进行分子分型研究。方法:采用ERIC国际通用引物对33株解朊金黄杆菌进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,使用NTsys软件对电泳图进行聚类分析。同时,采用全自动核糖体分型方法对33株解朊金黄杆菌进行核糖体分型,采用Bionumeric软件对菌株进行聚类分析。结果:两种方法均可得到清晰的指纹图谱,可对33株解朊金黄杆菌进行分子分型。ERIC-PCR可扩增出3~9个100~10000 bp之间的条带,将菌株分为2个族群。全自动核糖体分型方法可将菌株分为2个亚型,每种亚型间菌株仍有细微差异。结论:同种菌株之间同源性达到99%以上,但仍在遗传进化关系上存在差异。来自同一地区的分离株有聚类成一类的趋势,且与菌株的产酶能力存在密切关联。研究结果表明聚类于族群Ⅱ的菌株基本都来自于河南,且该类群菌株的产酶能力明显高于族群Ⅰ。  相似文献   

13.
目的:了解肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性情况以及各生产环节菌株间亲缘关系,为临床用药及菌株追踪溯源提供依据。方法:采用微量肉汤稀释法对171 株肠炎沙门氏菌进行13 种抗菌药物药敏实验;采用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)法对33 株不同生产环节耐药菌株进行分子分型;采用SPSS 20.0软件、Gel-Pro Analyer 4.0和NTSYS pc 2.1软件进行分析。结果:171 株肠炎沙门氏菌对13 种药物耐药情况不同,其中对氨苄西林耐药情况最严重,耐药率高达90.06%,对恩诺沙星、氧氟沙星最为敏感,耐药率均仅为5.26%;不同环节间耐药性差异极显著(P<0.01);多重耐药率高达95.32%,共有26 种耐药谱型。不同环节的33 株肠炎沙门氏菌分为4 种(Ⅰ~Ⅳ)基因型,遗传相似性在66%~100%,Ⅰ型为优势基因型;基因型相同的菌株耐药谱不一定相同,反之,耐药谱相同的菌株基因型不一定相同。结论:肉鸡生产链条中沙门氏菌对多种抗菌药物产生耐药性,且耐药谱种类繁多;沙门氏菌能够沿着生产链进行水平传播,肉鸡场环节菌株基因型相对复杂,菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性。  相似文献   

14.
探讨食品中常用的两种化学防腐剂(苯甲酸钠、尼泊金乙酯)和两种天然防腐剂(Nisin和ε-聚赖氨酸)对导致食醋产膜的芽孢杆菌的抑制作用。本试验通过试管二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),琼脂平板扩散法中的打孔法测定抑菌圈。试验结果表明,四种防腐剂的抑菌效果大小为:Nisin>ε-聚赖氨酸>尼泊金乙酯>苯甲酸钠。Nisin抑菌效果最好,对1号,2号,3号芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的抑菌圈分别达到20.1 mm,21.1 mm,21.3 mm,17.5 mm,MIC分别为1.25,1.25,0.625,0.625 mg/mL。  相似文献   

15.
调查中山市某菜市场生鲜畜禽肉中变形杆菌的污染情况,分析占优势的奇异变形杆菌的亲缘关系。采集268 份生鲜畜禽肉样品,使用聚合酶链式反应检测和生化实验的方法对污染的变形杆菌进行分离鉴定,并利用肠杆菌基因间保守重复共同系列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)技术对分离的奇异变形杆菌进行分子分型及同源性分析。结果表明:所有类型的样品受变形杆菌污染严重,程度由大到小依次为鸡肉、鸭肉和猪肉;PCR与生化鉴定结果一致,共检出123 株变形杆菌,变形杆菌阳性携带率为51.6%,其中117 株为奇异变形杆菌;ERIC-PCR指纹图谱条带均为3~9 条,呈现良好的多态性;101 株奇异变形杆菌集中分布在E、I、K簇,簇内相似性大于70%。ERIC-PCR技术适用于奇异变形杆菌的分型及同源性研究,对变形杆菌引起的食品污染和亲缘性溯源具有重要意义。  相似文献   

16.
研究扩展青霉DNA的提取及其聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测条件的优化。分别采用玻璃珠法、氯化苄法、玻璃珠+氯化苄法提取扩展青霉菌及对照菌株的基因组DNA,经紫外测定和电泳检测实验,分析提取DNA的质量浓度和纯度;同时,根据扩展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因内一段保守序列设计合成一对288bp的扩增引物,并对PCR检测条件进行优化。结果表明:玻璃珠+氯化苄法提取到的DNA质量浓度和纯度较理想,扩展青霉DNA可获得良好的特异性扩增,PCR扩增的最适退火温度为53~59℃,最适引物浓度为0.04~0.16μmol/L,最适模板质量浓度为2.40~5.28μg/mL,dNTPs浓度对PCR扩增影响不大。运用实验所得优化参数检测扩展青霉菌,整个过程仅需3~4h,和传统的培养检测法相比,该方法可有效提高检测效率,可进一步将该方法应用于实践。  相似文献   

17.
用于转基因检测的水果果肉总DNA提取法   总被引:1,自引:0,他引:1  
段婧婧  肖琳  陈军 《食品科学》2009,30(3):231-234
本研究以木瓜等水果果肉为实验材料,对改进的CTAB 提取方法进行优化,探讨适宜的果肉冷冻干燥粉的量和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的添加量。最终确定加入0.10g 果肉冷冻干燥粉较为合适,提取缓冲液中PVP 添加1.0% 时效果较好。此方法有效的去除了水果果肉中多酚和多糖类物质的影响,提取出的DNA 浓度较高,A260/A280 值介于1.80~2.00 之间。通过比较,改进的CTAB 法优于SDS 法和DNA 提取试剂盒法。以所提取出的木瓜、哈密瓜、香蕉、梨果肉总DNA 为模板,对内源rbcL 基因进行PCR 扩增,均得到了433bp 大小的目的条带。  相似文献   

18.
This study evaluated the genetic similarity and prevalence of the stx1, stx2, eae, and ehxA genes in Escherichia coli isolated from pasteurized cow milk. Eighty‐seven E. coli isolates from pasteurized cow milk from 22 dairies located in northwestern Paraná state, Brazil, were analyzed. Genetic similarity was evaluated using enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence polymerase chain reaction (ERIC‐PCR) and repetitive extragenic palindromic sequence PCR (REP‐PCR). E. coli isolates were also analyzed by PCR to investigate the presence of the stx1, stx2, eae, and ehxA genes. ERIC‐PCR and REP‐PCR clustered 87 bacterial isolates in 76 and 81 genomic profiles, respectively. Both techniques revealed high genetic diversity among the E. coli isolates, confirming the possibility of their use in epidemiological studies. The stx1, stx2, eae, and ehxA virulence genes were not detected in E. coli isolates, indicating a low prevalence of Shiga toxin‐producing E. coli in milk produced in the region studied.  相似文献   

19.
PCR-based methods are widely used in the European Union and in other countries for the detection, identification, and quantification of genetically modified organisms (GMOs). The preparation of good-quality DNA from plant samples for GMO detection can be a challenging task, particularly if the DNA will be used for quantitative analysis. Two DNA extraction methods, namely manual (NucleoSpin Food kit from Machery-Nagel) and high-throughput partially automated (NucleoMag Plant kit from Machery-Nagel) methods, which utilize different DNA separation principles, were used for the isolation of DNA from maize flour samples. Despite the higher DNA recovery obtained using the high-throughput isolation method, a lower PCR efficiency was achieved, most likely due to the presence of PCR inhibitors in the extracts. We found both DNA extraction methods suitable for GMO analysis.  相似文献   

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