人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中,并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选,并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后,进行序列测定。序列测定结果显示,该基因结构正确,且准确插入到表达载体启动子的下游,获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后,以SDS-PAGE电泳鉴定,电泳结果表明,该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整,在体外获得了高效表达的重组蛋白,高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示,随诱导时间的增加,重组蛋白产量逐渐增高,经4h诱导,其表达量可以达到平台期,过长时间的诱导,对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化,获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法,用Sephadex G150,对重组蛋白进行脱盐复性,使重组蛋白得到了进一步纯化。     

可在鱼体内表达hu-IFN-α的基因重组构建及转化

通过分子重组,将人α－干扰素（hu-IFN-α）基因编码序列克隆到鲤鱼β－肌动蛋白基因启动子下游,构成成能在鱼体内组成型表达hu-IFN-α的基因重组分子。经限制性酶切分析、Southern杂交和序列测定,证明重组分子构建的正确性。采用显微注射法将这一重组基因转化草鱼受精卵,获得了表达人α-干扰素的转基因草鱼。     

牙鲆自然杀伤细胞增强因子(NKEF)全长cDNA的克隆及表达分析

采用快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA ends,RACE）的方法,分离和测定了牙鲆自然杀伤细胞增强因子（NKEF）cDNA的全长核苷酸序列,5’RACE扩增分离得到了400bp左右的片段,3’RACE扩增得到了800bp左右的片段,经过拼接得到了牙鲆NKEF全长cDNA序列。牙鲆NKEF cDNA全长1028bp（不包含polyA）,其中包括67bp的5’非翻译区、597bp的开放阅读框和364bp的3’非翻译区（不包含polyA）,整个开放阅读框编码198个氨基酸。RT—PCR分析表明,NKEF基因在牙鲆不同组织中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。研究结果为提高牙鲆自身免疫防御能力的研究提供了理论依据。     

利用Cre/lox重组系统在转基因动物中筛选高效表达外源基因的"友好"基因座

本实验的目的是利用Cre／lox重组系统进行“友好”基因座的筛选,即利用一个两端带有lox位点的标记基因去转染动物细胞或生产转基因动物,获得可以高效表达外源基因的“友好”基因座。一旦筛选到好的基因座,就建成了一个可以在动物体稳定地高效表达外源基因的技术平台。为此,利用野生型loxP位点和含有一个点突变的lox511位点分别构建两个载体pSL-loxGFP和pSL-loxIFN。首先将含有GFP和新霉素基因的质粒pSL-loxGFP DNA转染牛胎儿成纤维细胞,并用G418筛选,挑选出发绿色荧光的细胞克隆。经增殖培养之后,再将含有鸡γ-干扰素基因的质粒pSL-loxIFN和含有Cre重组酶基因的质粒pBS185 DNA共转染发荧光的细胞克隆,筛选出发生重组后不再发光的细胞克隆。用PCR法检测了两个不发荧光的细胞克隆及发荧光的细胞克隆,并使用质粒pSL-loxIFN、质粒pSL-loxGFP及牛基因组作为对照。检测结果显示,在Cre重组酶的作用下,两个不发荧光的细胞克隆中,一个发生了基因置换,另一个发生了基因删除。以上实验表明,巧妙地用Cm／lox重组系统,可以构建一套使外源基因在动物体内定点地高效表达的技术体系。     

中国对虾部分基因组文库构建和微卫星DNA序列的筛选

以中国对虾为实验材料,提取肌肉的基因组DNA。经Bsp143Ⅰ酶切后,回收500～1000bp的DNA片段,与经BamHⅠ酶切并去磷酸化的PUC19重组,将重组载体转入大肠杆菌DH5α中。然后将其涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,过夜培养后,经蓝白斑筛选,构建对虾部分基因组文库。采用载体质粒的通用引物进行PCR检测插入片段的大小,对基因组文库进一步进行筛选。从建立的文库中选取100个片段大小合适的克隆进行测序,其中54个克隆的DNA插入片段含有微卫星序列,共获得了111个微卫星序列,在GenBank中注册了12个微卫星序列。本实验中还发现1个含有23bp的小卫星序列。     

斜带石斑鱼生长催乳素基因全长cDNA的克隆、表达及其免疫荧光分析

我们从斜带石斑鱼垂体的SMART cDNA质粒文库中筛选到生长催乳素基因(so-matolactin,SL)的全长cDNA片段,其编码区为1644bp,编码231个氨基酸,其中N-端的24个氨基酸肽段为信号肽。运用RT-PCR技术考察了其在石斑鱼不同组织中的mRNA的转录水平,结果表明,该基因在垂体中大量转录,在其他组织中几乎检测不到转录本的存在。选取基因开放阅读框的核苷酸序列插入pGEX-KG载体进行原核表达,在大肠杆菌中表达的融合蛋白的分子量约为50kDa,并以表达的产物为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。采用冰冻切片和FITC标记的荧光染色方法将SL基因初步定位于脑垂体中部,沿着神经组织边缘分布。本研究为深入研究石斑鱼的生长激素／催乳激素家族的进化关系及SL基因的功能奠定了基础。     

猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物，通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(hog cho1era lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段，并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接，一并克隆到pPo1y2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明，HCLV基因组长度共12310bp，有一个大的ORF，编码-3898个氨基酸的多聚蛋白。其5’—NCR和3’—NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较，HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT，该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明，毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。     

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素(AIV HA)基因串联后(拥有同一个阅读框)和鸡白细胞介素-18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子1(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.