利用绿色荧光蛋白建立包涵体变-复性新方法

为提高常规稀释复性方法的复性效率,以重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)包涵体为模型,开发一种新的双变性- 稀释复性方法。新方法选取含有精氨酸的碱性复合溶液作为第一变性剂溶解GFP 包涵体,通过梯度降低变性液的酸碱度析出溶解目的蛋白,再以尿素为第二变性剂溶解析出的蛋白,随后进行稀释复性。结果显示：与常规方法比,新方法复性的绿色荧光蛋白活性收率提高至1.5～2.3 倍,复性蛋白对温度、溶液酸碱度及变性剂的稳定性提高。增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP)及其融合蛋白的包涵体采用新方法进行复性,均取得80% 以上的活性回收率,说明新方法对GFP 系列融合蛋白的包涵体具有一定的适用性。新方法从变性剂使用与包涵体结构的关系出发,突破常规操作中变性剂单次使用的局限,既保留了简便性又提高了常规稀释复性方法的效率。     

重组人EC-SOD包涵体的复性

目的将E.coli中表达的人胞外超氧化物歧化酶(hEC-SOD)包涵体进行复性.方法分离包涵体,用8mol/L尿素溶解后进行透析复性.结果包涵体蛋白可以部分复性,比活达到900U/mg protein.结论透析复性法可以复性EC-SOD包涵体.     

紫红链霉菌2917磷脂酶A_2在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达与复性

通过化学合成紫红链霉菌2917分泌型磷脂酶A2全基因序列后插入融合表达载体pGEX-6P-1中,经酶切和测序鉴定无误后转化E.coli Rosetta(DE3)菌株,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得目的蛋白后对包涵体形式的重组蛋白进行稀释复性,同时对复性后的蛋白进行酶学研究.结果表明磷脂酶A2基因在大肠杆菌中获得了高效表达(占总细胞蛋白30%),复性后酶液酶活性为0.15U/mL。这将为包涵体的复性研究以及磷脂酶A2结构和功能的研究打下良好的基础。     

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体蛋白的柱上复性

N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAO)具有广泛的底物选择性,可用于多种活性氨基酸的酶法拆分,具有广阔的工业应用前景。文中采用多种洗涤剂对重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体进行洗涤去杂,并用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱和三缓冲体系作为复性系统对重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体进行复性实验。结果表明,4mol/L尿素与0.5%Triton X-100联合洗涤可以大量去除杂质;三缓冲体系能有效地实现重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体的柱上复性。在流速为0.5 mL/min,尿素梯度为21 mL,尿素终浓度为1.8mol/L,蛋白质上样量为0.99 mg的实验条件下,蛋白回收率和复性酶比活分别达到52%和10.27 U/mg。     

猪溶菌酶在大肠杆菌中的表达及其复性

作为C型溶菌酶的一种,猪溶菌酶(Sus scrofa lysozyme,SSL)是猪体内抵抗外源性疾病的一道重要屏障。鉴于猪在畜牧行业中的重要地位,尤其是在饲用抗生素的使用严重受限的今天,SSL的生产显得尤为迫切。化学合成得到了SSL的编码基因,通过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切之后与载体p ET-28a(+)连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在25℃、200 r/min条件下,利用0.1 mmol/L的IPTG诱导8 h,离心发酵液获得菌体。对其进行超声破碎获得重组蛋白包涵体,然后对包涵体进行复性,最终获得了具有生物活性的目的蛋白,并对其酶学性质以及抗菌活性进行了研究。超声破碎后获得了181.05 mg/L的重组蛋白包涵体,对包涵体进行复性后,比酶活力可达8 032.78 U/mg,其最适温度为35℃,最适p H为6.0,与其理论值基本一致,而其抗菌活性与标准品溶菌酶的作用效果也比较类似,为其规模化生产与进一步应用奠定了理论基础。     

重组人EC—SOD包涵体的复性

目的将E．coil中表达的人胞外超氧化物歧化酶(hEO-SOD)包涵体进行复性。方法分离包涵体，用8mol/L尿素溶解后进行透析复性。结果包涵体蛋白可以部分复性，比活达到900U／mg protein。结论透析复性法可以复性EC-SOD包涵体。     

肌氨酸氧化酶的酶学性质及失活机理

将来源于Bacillus sp.的肌氨酸氧化酶(SOX)基因在E.coli成功表达,并探索了肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase)酶学性质和失活机理。Bacillus sp.的肌氨酸氧化酶基因克隆入载体p ET28a,并转化至E.coli BL21(DE3)表达。经IPTG诱导8 h,对菌体破壁液进行SDS-PAGE电泳分析,发现在43 kDa处有明显蛋白质条带。采用亲和介质分离纯化获得较高纯度SOX。SOX酶学性质分析结果表明,其相对分子质量为43.8 kDa,最适反应温度40℃,最适反应pH值为8.0;20 mmol/L的Mn~(2+)对SOX具有明显激活作用;其动力学参数分析表明,肌氨酸作为底物时的K_m值为141.6 mmol/L,V_(max)为0.115 mmol/(L·min)。结合SDS-PAGE凝胶电泳、荧光光谱和圆二色性光谱分析,探明了液态SOX的失活机理。在37℃恒温条件下,随储存时间延长,SOX酶分子内部疏水基团逐渐暴露且二级结构被破坏,导致酶分子变性以及最终酶活力下降。为进一步提高SOX的酶活稳定性提供了理论依据。     

创伤弧菌外膜蛋白VuuA的表达纯化及复性

对创伤弧菌重组外膜蛋白VuuA进行表达纯化及复性,以获得可溶性VuuA蛋白。构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a-vuuA,利用IPTG诱导表达重组蛋白VuuA,利用亲和层析分离纯化蛋白并对包涵体进行复性。VuuA蛋白主要以包涵体形式存在于重组工程菌细胞内,经复性后和亲和层析纯化后,蛋白浓度达到28.2mg/L发酵液,有效提高可溶性蛋白的浓度。VuuA蛋白的纯化及复性为创伤弧菌新型疫苗的制备奠定了基础。     

大肠杆菌表达包涵体蛋白体外复性研究进展

包涵体形成是大肠杆菌表达重组蛋白常见的问题.因此,为获得大量的活性蛋白而对其包涵体进行复性的研究引起了人们极大兴趣.本文综述了近年来发展起来的低分子量添加物、反胶团、分子伴侣、层析复性等新的复性方法、复性检测方法和体外复性机制.     

重组牛乳铁蛋白肽包含体的复性与纯化

通过分析透析液pH值，包含体蛋白浓度，DTT浓度3个参数对复性率的影响，确定了重组牛乳铁蛋白N-末端多肽（pGEX-4T1／rbLF—N）包含体透析复性的最佳条件和复性后蛋白纯化的适宜方法。采用谷胱甘肽琼脂糖凝肢4B柱（Glutathione Sapharose^TM 4B）时复性后的蛋白溶液进行纯化．纯化后的融和蛋白经胃蛋白酶酶解并检测其酶解产物的抗菌活性。试验表明包涵体蛋白可以部分复性。当pH值为8．5，包含体蛋白质量浓度为100mg／L，DTT浓度为24mmol／L，包含体的复性率最高。纯化后的融合蛋白酶解产物具有抗菌作用。