瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母中的表达研究

将PCR合成的瑞氏木霉 (Trichodermareesei) β 内切葡聚糖酶I(EGI)cDNA基因片断分别插入酵母met1 0和 pgk1启动子和终止子序列之间 ,构建了在不同启动子控制下 ,具有不同拷贝数的eg1表达分泌质粒pRS41 5ME、pRS41 5PE和 pRS42 5PE。通过电转化使重组质粒转移至实验室酿酒酵母H1 5 8菌株中 ,分别得到了 3株酵母转化子H1 p、H2p和H1m。在 3株酵母转化子中 ,重组 β 内切葡聚糖酶I都能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达。在YPD培养基中 3株重组酵母生长速率大致相同 ,H1m ,H1 p与H2 p的内切葡聚糖酶活力分别为 70 .4,1 2 6.7和 1 2 5 .0U/mL。     

一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

在大肠杆菌中实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达。将实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因（bgl）进行融合连接到p ET-28a（+）上;通过优化诱导表达条件,28℃、8 g/L乳糖诱导10 h,重组菌E.coli BL21/p ET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/m L,与IPTG诱导的重组菌E.coli BL21/p ET-bgl（583 U/m L）相比,提高了0.87倍。本研究为高密度发酵制备该酶奠定了基础。      

重组β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中的共表达

β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖苷酶是纤维素酶的重要组分,多基因的共表达在各领域有重大的应用价值,本研究利用pET32a和pET30b两个载体的不同抗性的特性,在大肠杆菌中将β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因,实现了不相容性共表达,获得了产两种酶的工程菌,酶活力可达1196.8U/mL。比单一酶组分的酶活力高,酶学性质分析显示共表达酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度60℃,在pH5⁷范围内能保持较高活性,酶活可达最高酶活的80%以上,在30⁶0℃范围能有较高的温度稳定性,酶活维持在80%以上。这一结果将为工业应用的进一步研究提供理论基础。      

内切葡聚糖酶基因cel7b 在里氏木霉中的同源表达

用里氏木霉（Trichoderma reesei ）作为宿主同源表达内切葡聚糖酶基因。运用聚合酶链反应（PCR）技术从里氏木霉cDNA中扩增得到内切葡聚糖酶基因cel7b序列,并将其连接到载体p18-m2上构建重组质粒,将重组质粒转化到里氏木霉菌株中,通过筛选获得表达内切葡聚糖酶的重组里氏木霉工程菌。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示,发酵液中重组内切葡聚糖酶的分子质量约48 ku。摇瓶发酵结果显示,内切葡聚糖酶在重组里氏木霉中得到分泌表达,发酵液中的内切葡聚糖酶和滤纸酶活分别达到了726 U/mL和28.7 U/mL,分别为出发菌株酶活的2.9倍和1.1倍。玉米芯进行糖化试验结果显示,重组里氏木霉所产酶液糖化玉米芯的酶解得率为81.4%,比出发菌株提高了6.3%。     

内切–β–1,4–葡聚糖酶基因在茌梨果实发育及成熟中的表达模式分析

本研究以茌梨(Pyrus bretschneideri Rehd.Cv.Chili)果实为材料,分析了内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGase)基因Pb EG3和Pb EG4在果实发育及成熟衰老时期的表达模式。茌梨果实中Pb EG3和Pb EG4的基因表达量均于发育时期呈现峰值,其中,Pb EG3的基因表达量在花后70 d达到峰值0.31,花后130 d降至0.003;而Pb EG4的基因表达峰值于花后110 d出现,为0.14,花后130 d降为0.005,与EGase的活性变化趋势一致。0℃贮藏期间,茌梨果实中Pb EG3和Pb EG4的基因表达量均呈下降趋势,且二者均在采收点呈现最大值,其中Pb EG3于采后60 d表达量最低,之后表达量略有升高;而Pb EG4在贮藏期间的表达量均较低。采后乙酰水杨酸(ASA)处理能够减少茌梨果实的失重,抑制其可溶性果胶的增加,降低EGase活性,延缓纤维素的降解,从而推迟果实的成熟衰老进程。Pb EG3和Pb EG4可能与茌梨果实的生长发育有关,未参与其采后衰老进程。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)基因克隆与表达

绿色木霉Sn-9106是一株分解纤维素能力较强、能利用秸秆固体发酵生产纤维素酶的工业菌株.通常丝状真菌纤维素酶合成受纤维素、槐二糖等的诱导.本研究利用秸秆粉诱导绿色木霉Sn-9106纤维素酶基因,在诱导3.5d时,纤维素酶组分之一——葡聚糖内切酶Ⅰ的mRNA转录达到峰值,收集菌丝提取总RNA,以单链cDNA为模板,PCR扩增获得编码葡聚糖内切酶Ⅰ基因(egl1),去除信号肽序列后构建重组质粒PET-egl1,实现其在大肠杆菌中的表达,所得重组葡聚糖内切酶经组氨酸标签亲和层析纯化得到单一的E-GI蛋白,SDS-PAGE检测为49ku,活力为2.37U/mL.     

绿色木霉葡聚糖内切酶(EGⅠ)基因克隆及在酿酒酵母中的表达

以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目的基因在酿酒酵母Fm135a中成功表达,所得葡聚糖内切酶经初步纯化后,SDS-PAGE检测为49 kD,比活力为2.45 U/mg。     

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。     

黑曲霉内切β-葡聚糖酶的纯化和性质

黑曲霉(Aspergillus niger)的粗酶滤液经过硫酸铵沉淀和四种色谱CM-Sephadex C-50离子交换色谱、DEAE-Sephadex A-50离子交换色谱、POROS 20 HQ离子交换色谱和TSK-G3000SW凝胶色谱,从中提纯了一个新的内切β-葡聚糖苷酶该酶经SDS-PAGE电泳检测分子量为36.0KD,该酶活力的最适温度为70℃,最适pH值为3.6 纯化后的该酶只能降解羧甲基纤维素,不能降解微晶纤维素,对蔗糖、麦芽糖和纤维素也不起作用。其N-末端部分氨基酸序列为V F E W F G C N E C G A E F Tx N I P G。     

两阶段pH和搅拌控制策略提高哈茨木霉产β-1，3-葡聚糖内切酶

为提高哈茨木霉(Trichoderma harzianum GIM 3.442)发酵生产β-1,3-葡聚糖内切酶的酶活E_(endo)及其内切酶酶活在总酶活中所占的比例E_(endo)/E_(total),在7 L发酵罐水平考察了不同p H和搅拌转速对菌体和产酶的影响。结果表明,单一p H或搅拌转速的优化不能使菌体生长和产物合成同时达到最优效果。通过分析不同p H和转速下发酵曲线和动力学参数,提出了两阶段p H和搅拌转速控制策略:在发酵前期(0~24 h)控制p H 7.0,搅拌转速100 r/min,发酵后期(24~168 h)控制p H 5.0,搅拌转速200 r/min。β-1,3-葡聚糖内切酶(E_(endo))、酶合成生产强度(Q_(E,endo))和E_(endo)/E_(total)分别达到了407.8 U/m L、3.09 U/(m L·h)和0.71,比优化前分别提高了320.0%、398.4%和65.1%。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

热纤梭菌β-葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取热纤梭菌(Clostridium.sp)基因组DNA,首次通过PCR克隆了该菌的β-葡聚糖酶基因全长。结果表明:该基因全长1040bp,ORF为1003bp,编码334个氨基酸,计算分子质量为37.8kD,等电点为7.67。经Blast分析,该序列与热纤梭菌同源性最高(99%),而与基因库中嗜热梭菌的同源性为94%,该基因已被GenBank接受(AY225318)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET-30a(+)后相连接,构建重组表达载体pET-clo,并导入BL21细菌中表达。酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在37kD左右有表达蛋白带,该工程菌最适酶活29.4U/mL,是出发菌的15倍,最适温度80℃,最适pH9。该工程菌可作为耐热性材料构建耐热性好、酶活高的杂合基因工程菌。     

毕赤酵母中内切β-1,4葡聚糖酶的表达及共培养制备低分子质量黄原胶

低分子质量黄原胶具有抑菌、益生及抗氧化等多种生物活性,因此通过水解制备低分子质量黄原胶具有广阔应用前景。该研究将来源于绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶首次在毕赤酵母中表达,其在pH 7.0和75℃下发挥最佳作用,并有较高的pH和温度稳定性。此后,建立了毕赤酵母和野油菜黄单胞菌的共培养体系并对发酵条件进行优化,其中野油菜黄单胞菌生成的黄原胶可以被毕赤酵母分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶直接降解产生低分子质量黄原胶。摇瓶水平下,共培养体系中总糖最高为11.4 g/L,水解产物中重均分子质量为2 500 Da的低分子质量黄原胶达到93.79%。该研究为功能性低分子质量黄原胶的工业化生产提供了一个潜在的策略。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

绿色木霉内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质研究

采用DEAE-650C弱阴离子交换层析、CM-650M弱阳离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶层析和Octyl Sepharose CL-4B疏水层析等分离纯化技术,从绿色木霉M1发酵液中分离纯化得到4个电泳纯的内切葡聚糖酶组分(EG1、EG2、EG3和EG4),比活力分别为41.83,139.96,117.72,126.50 U/mg,分子质量分别为25.4,28.8,56.3,60.5 ku,最适反应温度分别为50,45,55,60℃,最适反应p H分别为6.0,5.0,4.0,5.0,米氏常数Km值分别为9.51,5.06,4.16,4.86 mg/m L。组分EG1、EG3和EG4在30~50℃范围较稳定,组分EG1、EG2和EG4在p H4.0~6.0范围稳定性较好,而组分EG3只在p H5.0的条件下较稳定。Zn2+、Mg2+和K+对组分EG4有激活作用,对组分EG1、EG2和EG3有抑制作用,Ca2+对组分EG1、EG2和EG3有激活作用。     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆

以绿色木霉（Trichoderma viride）的总RNA为模板,根据GenBank上检索的β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ（M55080）DNA序列,设计特异性引物,进行PT-PCR扩增bglⅠ片段,将其连接到pMD18-T载体并转化到大肠杆菌JM109测序。测序结果表明,所获得的DNA序列与GenBank上检索的β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列同源性达98.8%。      

编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ的基因克隆与表达研究

采用RT-PCR法,以草菇Volvariella.volvacea V23总RNA为模板,克隆了包括自身信号肽在内的中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egⅠ)的cDNA序列。测序结果表明,它全长1167 bp,编码389个氨基酸,推测第1～23位氨基酸为信号肽,第24～389位氨基酸为成熟肽,属于糖苷水解酶第5家族。PCR扩增成熟肽编码基因并将其插入到分泌型表达载体pPIC9K中,重组载体经SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到了1株高产中性内切葡聚糖酶Ⅰ的工程菌株P.pastoris-EGⅠ1。SDS-PAGE检测表明,重组中性内切葡聚糖酶Ⅰ分子质量约为42 ku。在甲醇诱导96h时,酶活达到3 698 U/mL。