东南亚地区寨卡病毒的流行及结构蛋白分子进化特征分析

目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在东南亚地区的感染传播情况,探讨其分子水平上的进化特征。方法用关键词和主题词检索ZIKV在东南亚地区暴发感染流行情况。在GenBank中获取ZIKV东南亚病毒株全基因序列,采用BIOEDIT软件进行比对;利用MEGA 7. 0软件绘制系统进化树;将结构蛋白核苷酸翻译获得其相应的氨基酸序列,分析突变情况;统计不同株型间结构蛋白核苷酸突变和氨基酸替代位点;预测包膜蛋白第三结构域(envelop domainⅢ,ED-Ⅲ)的二级结构。结果 ZIKV在东南亚国家均有血清学感染或回顾性检测阳性报道,其中越南、泰国和新加坡ZIKV感染病例较多,疾病负担较为严重。系统进化树表明,东南亚ZIKV株均属于亚洲型,2016年新加坡株(序列号:KY241788)与2015年巴西株亲缘关系最近,1966年分离的马来西亚株与其他东南亚株亲缘关系较远。东南亚ZIKV各株型间衣壳蛋白(capsid protein,C)的碱基突变点为22处,突变率为6. 36%,造成非同义氨基酸突变点为19处,突变率为16. 52%。前膜蛋白(pre-membrane protein,prM)的碱基突变点为51处,突变率为10. 12%,造成非同义氨基酸突变点为37处,突变率为22. 02%。包膜蛋白(envelope protein,E)的碱基突变点为141处,突变率为9. 33%,造成非同义氨基酸突变点为101处,突变率为20. 04%。ED-Ⅲ二级结构预测结果显示,在该区域2株代表株有相同数量的蛋白结合位点,代表株2(1966 Malaysia KX377336)存在1个蛋白结合位点富集区(ED-Ⅲ:55-63),而代表株1(2014 Thailand KU681081)蛋白结合位点分布较均匀,代表株2的ED-Ⅲ存在1个二硫键,而代表株1不存在,代表株1(ED-Ⅲ:79-80)存在1个解螺旋,而代表株2不存在。结论通过病例统计分析、系统发育分析、蛋白质核苷酸及氨基酸序列比较分析、ED-Ⅲ二级结构预测,为研究东南亚地区ZIKV不同株型间的生物学和流行致病性差异提供参考。     

登革病毒1型Ⅰ～Ⅴ基因亚型的基因组差异分析

目的分析登革病毒1型(Dengue virus type 1,DENV-1)Ⅰ～Ⅴ基因亚型基因组全长核苷酸及氨基酸序列差异。方法通过GenBank搜索DENV-1 5个不同基因亚型的全长基因组序列,获得其相应的氨基酸序列。采用BIOEDIT软件,统计基因亚型间核苷酸突变和氨基酸替代位点,分析其相似度,通过RNA二级结构在线预测网站预测DENV-1不同亚型间3′UTR的二级结构差异,蛋白结构在线预测网站预测主要流行于中国的Ⅰ及ⅤDENV-1基因亚型结构蛋白的二级结构,对其氨基酸组成及编码序列中可能存在的蛋白结合区域等进行差异分析。结果DENV-1 5个基因亚型核苷酸相似性为91. 40%～94. 50%,氨基酸序列相似性为97. 11%～98. 38%,5个基因亚型各自编码3 392个氨基酸,其中共有195个位点有氨基酸的变化。DENV-1不同亚型的3′UTR的二级结构各不相同。DENV-1基因型为Ⅰ、Ⅴ的775个氨基酸中占组成比例最多的均是苏氨酸(T),Ⅰ型可能的蛋白结合位点有26个,多聚核苷酸结合位点有9个。Ⅴ型可能的蛋白结合位点有24个,多聚核苷酸结合位点有7个。他们均有相同数量的螺旋和跨膜螺旋。结论通过对DENV-1 5个不同的基因亚型的全长核苷酸和氨基酸序列的比较分析,及Ⅰ、Ⅴ基因亚型结构蛋白二级结构的预测,为研究DENV-1不同基因型之间的生物学和致病性差异提供参考。     

亚洲西尼罗河病毒的系统发育及E蛋白分子进化特征分析

目的 分析亚洲区西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)的流行情况,探讨其系统发育和分子进化特征.方法 从NCBI数据库中分别获取亚洲区流行的WNV 全基因组序列和E 蛋白序列,进行比对和同源性分析后构建系统进化树,分析来自不同株型病毒的结构蛋白E 的核苷酸和氨基酸的突变率,进一步找出氨基酸的替代位点.结...     

肠道病毒71型吉林分离株的全基因组序列分析

目的对2011年吉林省肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)分离株全基因组进行序列分析。方法将手足口病伴发重症脑炎患者的粪便样品接种至Vero细胞,分离EV71;采用RT-PCR法分8段扩增全基因组序列,进行双酶切及序列测定;应用Mega5软件构建EV71系统进化树;通过DNAMAN7和DNASTAR7软件进行EV71分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性比较;经RDP4软件对EV71分离株进行同源重组分析。结果粪便样品接种至Vero细胞2 d后,细胞出现圆缩、透亮、聚堆的病变现象;各PCR扩增产物经双酶切鉴定,均可见与预期大小一致的目的条带;经种系进化树分析显示,EV71分离株属C4a亚型,命名为EV71-JiLin-11-China;其与A、B和C亚型间核苷酸序列的平均同源性分别为22.44%、17.72%和11.96%,与A、B和C亚型间氨基酸序列的平均同源性分别为96.0%、97.2%和97.3%;全基因同源重组分析显示,EV71分离株的165～1 946和7 289～7 366核苷酸区有重组现象,分别源于分离自湖北的C4a-EV71-Hubei-09-China及马来西亚的B4-SB2864-SAR-00和C1-S18062-SAR-98。结论 2011年吉林地区流行的EV71为C4a基因型,为EV71基因特征及流行病学的研究提供了实验依据。     

重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒型特异性遗传变异分析

目的分析重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的遗传多样性。方法采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV的2段结构蛋白和1段非结构蛋白的编码序列,并克隆至pMD18-T载体进行双向序列测定,所得序列在NCBI上进行BLAST搜索,以进行同源性分析;应用ClustalW2软件进行多序列比对分析;应用SNAP软件计算同义替换率(Synonymous substitution rate,dS)、非同义替换率(Nonsynon-ymous substitution rate,dN)及其比值(dS/dN);采用MEGA 4软件的邻接法(Neighbor-joining)中的最大可能性算法(Maximum likelihood method)构建系统进化树。结果 CSBV重庆分离株片段SB1-2、SB6-7和SB14-15的序列同源性高于99.06%,序列保守,3个片段序列均只发现少数点变异碱基,属于亚洲型,与东方蜜蜂广州分离株和韩国分离株的亲缘关系最近;CSBV重庆分离株存在特有的核苷酸和氨基酸位点,且与亚洲型分离株存在广泛的共有基序;亚洲型分离株的替换率高于欧洲型分离株。结论 CSBV分离株存在型特异的遗传变异规律。     

人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达

目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。     

产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变

目的　克隆产气荚膜梭菌 β2 毒素基因 ,并选择可能影响其生物活性的氨基酸的相关碱基位点进行定点突变 ,构建β2 毒素基因的突变体。方法　利用PCR从C型产气荚膜梭菌基因组DNA中 ,扩增出约 0 7kb的基因 ,将其克隆至pGEM T载体上。经GOLDKEY软件分析抗原表位 ,PCR定点突变技术进行 2 34位半胱氨酸→苷氨酸的定点突变。结果　β2 毒素基因核苷酸序列与报道的一致 ,其突变基因 6 99位核苷酸由T→G。结论　已成功克隆了 β2 毒素基因 ,并准确实施了预期定点突变。     

中蜂囊状幼虫病病毒重庆株编码序列分析

目的分析中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)重庆株(CSBV-CQ)编码序列的分子特性。方法采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV编码序列片段,并进行序列测定,使用ClustalW2软件进行多序列比对分析,利用推导的氨基酸序列进行保守结构域BLAST和同源建模,采用MEGA 4软件的邻接法(neighbor-joining)中的最大可能性算法(maximum likelihood method)构建系统进化树。结果扩增的片段拼接出8 358 nt的片段,约占SBV基因组长度的95%;CSBV-CQ与CSBV-GZ的核苷酸和氨基酸序列同源性均最高,在CSBV-GZ的2 270² 320位碱基缺失51 nt核苷酸;多聚蛋白N-末端包含2个小RNA病毒衣壳蛋白药物结合口袋(drug-binding pocket)结构域(domain),C-末端包含RNA解旋酶(RNA helicase)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)2个结构域;基于基因组水平的系统进化分析显示,所有东方蜜蜂分离株、西方蜜蜂分离株AmSBV-Kor19构成1个基因型,但基于基因组片段的分子系统进化分析显示,部分毒株包含2个基因型片段。结论 SBV基因型间存在基因重组现象。     

人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

树鼩白细胞介素-6的原核表达及其分子特征

目的原核表达树鼩(tree shrew,ts)白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因,并分析ts IL-6蛋白分子特征。方法以人、猴、啮齿类动物等IL-6 m RNA的共有序列作为查询序列,从树鼩c DNA数据库中进行本地blast,获得预测ts IL-6核苷酸序列,将其翻译成氨基酸序列,用MEGA 6软件进行核酸序列和氨基酸序列比对,绘制进化树。参考预测IL-6基因序列设计引物,PCR扩增IL-6基因序列,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-IL-6;转化感受态E.coli BL21(ED3),IPTG诱导表达,重组蛋白经14 KD透析膜梯度透析纯化;利用蛋白质在线数据库expasy进行蛋白质结构同源建模,并用Signal P sever预测ts IL-6的信号肽序列,经模板与预测模型的结构拟合来预测树鼩IL-6的gp130结合位点。结果 ts IL-6核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物有较高的同源性;重组表达质粒p ET-28a(+)-IL-6经双酶切鉴定证明构建正确;重组表达蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后可见单一目的条带,浓度为0.2 mg/ml;h IL-6和ts IL-6蛋白的空间结构较类似,ts IL-6的gp130结合位点Ⅱa位于A和C螺旋间,位点Ⅲa位于A和B螺旋的柔性链区及分子近C-端。结论 ts IL-6的核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物具有较高同源性,成功构建的重组原核表达质粒p ET-28a(+)-IL-6,为后续IL-6相关的病理研究奠定了基础。     

吉林省2011年手足口病死亡病例肠道病毒71型分离株全基因组基因特征分析

目的分析吉林省2011年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)死亡病例标本中分离获得的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)毒株全基因组基因特征。方法采用分段RT-PCR法对2011年吉林省HFMD死亡病例EV71分离株JL2011-56全基因组进行扩增和测序。利用Clustal X2和MEGA5软件构建分离株JL2011-56与Gen Bank中27株参考株的全基因组序列和VP1区全基因组序列的进化树,分析Jl2011-56株的流行病学特征;同时与Gen Bank中12株C4a基因亚型参考株进行全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。结果 JL2011-56分离株属于C4a亚型,核苷酸序列和氨基酸序列与山东分离株SDLY107(JX244186.1)同源性最高,分别为99.2%和99.5%,与EV71原型株Br Cr的同源性分别为79.9%和95.7%。结论 JL2011-56分离株与山东株亲缘关系较近,可能存在共同的与中枢神经毒力相关的氨基酸突变位点。     

人3型副流感病毒兰州分离株LZ22全基因组序列的测定及分析

目的对人3型副流感病毒(HPIV-3)兰州分离株LZ22进行全基因组序列测定并分析。方法通过引物步移法和RACE技术测定LZ22株的全基因组核苷酸序列,并分析其基因组结构特点和进化地位。结果LZ22株的基因组全长15462个核苷酸,符合副黏病毒科基因组"6碱基原则",按照3′-NP-PP/C-M-F-HN-L-5′的顺序编码6种结构蛋白,基因结构与已知序列HPIV-3分离株相同。与GenBank登录的4株HPIV-3参考株进行同源性比对发现,LZ22株与ZHYMgz01株(中国广州)的同源性最高,为99.0%(147个核苷酸变异),与14702株(加拿大)的同源性最低,为94.6%(832个核苷酸变异)。系统进化分析表明,LZ22株与ZHYMgz01株为同一进化分支,与GP株(日本)进化关系次之,与14702株和JS株(美国)进化关系最远。结论LZ22株病毒基因组具有副黏病毒的遗传特征,核苷酸序列与HPIV-3有高度的同源性。HPIV-3的系统进化可能与地域相关。     

树鼩CD4及IL-6分子的克隆及分析

目的克隆野生型中缅树鼩的CD4及IL-6分子,并分析其核苷酸、氨基酸序列的多态性及重要的功能位点。方法经野生型树鼩尾静脉采血,分离外周血单核淋巴细胞,经植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)刺激24 h后,提取细胞总RNA,以其为模板,进行RT-PCR扩增,扩增产物插入p MD-19T载体,提取阳性重组质粒,经双酶切鉴定及测序;采用Lasergene分析目的基因核苷酸及氨基酸序列,并构建进化树,分析野生型树鼩与已知中缅树鼩的亲缘关系。结果野生型树鼩CD4全长编码序列的开放阅读框长度为1 365 bp,编码454个氨基酸,IL-6全长编码序列的开放阅读框为627 bp,编码208个氨基酸,22只野生型树鼩成功克隆出CD4分子,23只野生型树鼩成功克隆出IL-6分子。不同野生型中缅树鼩的CD4及IL-6分子有不同程度的核苷酸和氨基酸位点的突变,但分别有35%和26.7%的碱基突变为同义突变,且发生非同义突变的位点对树鼩CD4和IL-6分子重要的功能位点无影响。由CD4核苷酸及氨基酸序列构建的系统进化树基本一致;由IL-6核苷酸及氨基酸序列构建的系统进化树中,23只野生树鼩分为2个分支。结论 CD4和IL-6分子具有重要功能的氨基酸位点是保守稳定的,为今后树鼩CD4和IL-6单克隆抗体的制备及树鼩实验动物模型的建立奠定了基础。     

Ⅰ型聚酮类天然产物中利用点突变产生类似物的研究

点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化）,包括碱基的添加、删除、改变等。通过构建发生突变的质粒利用遗传转移的方法同源重组到野生型基因组中,使得氨基酸改变从而引起蛋白功能发生变化,获得鉴定正确的突变株后发酵筛选结构类似物。聚酮类天然产物在生物合成过程中,其聚酮链会发生若干步氧化还原反应,通过点突变的方法失活该蛋白,从而跳过该步氧化还原反应的作用,产生PKS骨架上的改变,从而得到结构类似物。     

吉林省2001～2016年成人麻疹病毒核蛋白基因特征分析

目的分析吉林省2001~2016年成人麻疹病毒核蛋白(nucleoprotein,N)的基因特征。方法选取吉林省2001~2016年26株成人麻疹病毒代表株,分离病毒、提取核酸、通过RT-PCR扩增得到麻疹病毒N蛋白基因片段,测序后,运用生物信息学软件进行序列比对分析。结果吉林省2001~2016年成人麻疹发病构成比呈逐年升高趋势;26株成人麻疹病毒株均为H1基因型H1a基因亚型,与中国疫苗株S191和H1a代表株相比,其N蛋白核苷酸和氨基酸序列同源性均呈波动下降趋势;氨基酸突变位点数量显著增多,第47、77、82、117、122、136、147位点熵值较高,可变性较大。结论吉林省2001~2016年成人麻疹病毒N蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性逐年降低,基因突变位点数量显著增加,成人麻疹发病构成比逐年攀升,需持续监测成人麻疹N蛋白变异情况,并结合血清学和流行病学制定免疫策略,控制成人麻疹发病。     

2017年云南省登革病毒Ⅰ型分离株NS1基因的鉴定及分析

目的鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virusⅠ,DENVⅠ)分离株的NS1基因。方法采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENVⅠ的NS1基因,进行测序。应用BIOEDIT软件比对NS1及DENVⅠ标准株(DQ672562.1)的核苷酸及氨基酸序列,并进行突变分析。应用MEGA 5.1软件中的NJ法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树。结果共分离获得16株DENVⅠ的NS1基因,经比对发现,201703、201704、201708、201709、201713分离株NS1基因第21位碱基由C变为T(无义突变);201705、201706、201712分离株NS1基因第289位碱基由T变为A(有义突变),氨基酸曲L变为M。16株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共85处发生碱基突变,其中5个为有义突变。16株分离株与2011-China Donggua(JQ048541.1)、2008-Singapore(GU370049.2)、2014-Taiwan(KU365900.1)、2005-China Fujian(DQ193572.1)、2016-Malaysia(KX452065.1)、2007-Indonesia(KC762646.1)、2015-South Korea(KP406802.1)、2006-Japan(AB178040.1)、2007-Thailand(HM469966.1)、2013-singapore(KJ806945.2)有较近的亲缘关系。结论 2017年云南省16株分离毒株均为DENVⅠ,可能属于东南亚国家的输入性毒株。     

乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株全基因序列分析

目的对我国乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3株鼠脑53代(P3-Smb53)进行全基因序列测定及分析。方法提取P3-Smb53株病毒全基因组RNA,逆转录合成为cDNA,以其为模板分段进行PCR扩增,并测序;序列拼接后,利用NCBI的Blast程序和DNASTAR软件包中的MegAlign软件与GenBank中登录的5个基因型别的177株乙脑病毒全基因序列、551株乙脑病毒E蛋白序列进行比对。结果 P3-Smb53株病毒基因组全长10 976个核苷酸,与177株乙脑病毒株的全基因序列核苷酸同源性为79.6%~99.7%,氨基酸同源性为91.3%~99.7%;与GenBank中登录的551株乙脑病毒E蛋白氨基酸同源性为91.0%~99.8%,在E蛋白12个关键抗原性位点中,所有毒株均非常保守;与GenBank中登录的P3株全基因序列核苷酸同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.5%。结论乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株虽然与不同基因型毒株间的氨基酸差异较大,但在关键抗原位点上高度一致,理论上能够抵抗目前国内外所有乙脑分离株的感染。     

反向遗传学技术在流感病毒研究及流感疫苗发展中的应用

流感病毒是分节段负链RNA病毒,属于有包膜的正黏病毒科,分为甲、乙、丙、丁4个型别。流感病毒可引起流感季节性流行或大流行,导致严重的公共卫生和经济问题,接种疫苗可有效预防流感病毒的感染。反向遗传学技术对扩大人类对流感病毒的分子生物学和发病机制的认识产生了重要影响,通过突变流感病毒基因组中的特定核苷酸,阐明流感病毒基因组序列调控性质或特定氨基酸对流感病毒蛋白功能的作用。通过反向遗传学技术可将两种或多种病毒遗传物质进行重组,共感染细胞制备出重组病毒株,作为季节性流感疫苗或针对潜在大流行病毒株的疫苗。本文对流感反向遗传学技术在流感病毒研究及流感疫苗发展中的应用作一综述。     

N+离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌

利用N+离子注入诱变大肠杆菌,经甲氧苄啶的选择性筛选,得到胸腺嘧啶营养缺陷型菌株.通过重组DNA技术将该突变株胸苷酸合成酶(TS)基因连接到载体pMD-18T质粒上,经测序发现TS基因第173个碱基由AT→CG,其相应的氨基酸由谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58).该突变株的获得为后续研究嘧啶核苷酸的代谢奠定了基础.     

金黄葡萄球菌野生株肠毒素B重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中表达金黄葡萄球菌野生株肠毒素B(SEB)重组蛋白,并进行纯化。方法采用PCR方法从金黄葡萄球菌基因组中扩增出SEB基因片段,与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T/SEB,测序分析后,亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,转化感受态E.coliJM109,IPTG诱导表达。表达产物采用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit纯化后进行Western blot鉴定。结果SEB基因扩增片段大小为705bp,测序结果显示与金黄葡萄球菌S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%,存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364、699、899和988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser和Met→Leu);表达的含GST的融合蛋白相对分子质量约53000,纯化后经SDS-PAGE分析,可见单一条带。Western blot显示表达产物可被兔抗SEB抗体所识别。结论已成功表达并纯化了金黄葡萄球菌野生株SEB重组蛋白,为开发SEB免疫诊断试剂提供了材料。