重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的研制

目的制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,并按《中国药典》三部(2010版)要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃(8周)、37℃(4和8周)后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力检定的质控参考品。     

冻干重组乙型肝炎疫苗国家参考品的制备及标定

目的 制备1批冻干参考品,用于体外相对效力测定准确评价重组(啤酒酵母)乙肝疫苗的生物学活性。方法 疫苗原液中分别加入5％和1％的蔗糖和明胶作为保护剂,制成冻干参考品。检测各项质量指标并观察其稳定性,并以Merck公司的参考品为标准,以ELA法协作标定其体外相对效力。结果 各项质量指标均符合现行规程要求,体外相对效力保持稳定,分装量准确,原液蛋白均值为24.72μg/ml,相应液体疫苗蛋白均值为12.27μg/ml。并经3家实验室协作标定,24次检定结果合并计算相对效力为0.993。结论 该冻干参考品可用作重组啤酒酵母乙肝疫苗效力检定的质控参考品,该批参考HBsAg含量定为11.0μg/ml。     

冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)非动物源性稳定剂的筛选

目的筛选冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)非动物源性稳定剂,以替代传统的动物源性稳定剂。方法取同一批乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)原液,分别加入A、B、C、D稳定剂(非动物源性),制备成冻干剂型,分别检测其外观、水分、有效抗原含量和效力等,以传统稳定剂作对照,并考察其稳定性。结果冻干前后,疫苗的有效抗原含量及效力与对照无明显差异。加入D稳定剂(不含人血白蛋白和明胶)的冻干乙型脑炎灭活疫苗于37℃放置6个月,效力降低15.1%;于2～8℃放置2年,效力仍高于参考品。其他检测指标均符合要求。结论D稳定剂可替代传统稳定剂,用于制备冻干乙型脑炎灭活疫苗。     

无细胞百日咳疫苗效力国家参考品的建立

采用罐培养百日咳CS菌株,培养物经硫酸铵两段盐析、浸提后,再经蔗糖密度梯度离心,收集以FHA．PT为主的百日咳菌保护性抗原,经福尔马林解毒,制备成原液。该原液按照中国和日本的生物制品规程检定合格后,加入保护剂,稀释至18μgPN／ml,分装冻干制备成无细胞百日咳疫苗效力参考品。以JNIH3和JNIH－6参考品为标准,按照日本规程的小鼠脑腔攻击法标定其效力单位。根据14次效力试验所得的结果和日本NIH标定的结果,该批疫苗效力国家参考品的效力单位定为15PIU／ml。     

重组戊型肝炎病毒抗原ELISA检测方法的建立

目的建立重组戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于HE疫苗中HEV抗原含量的检测。方法以重组HEV病毒样颗粒作为免疫原,免疫母鸡,制备抗HEV-IgY多克隆抗体,纯化后作为包被抗体,HRP标记的抗HEV单克隆抗体作为检测抗体,建立HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行验证。用建立的方法检测3批HE疫苗成品的HEV抗原含量,计算HEV抗原对氢氧化铝的吸附率。结果建立的ELISA方法线性范围为2～128 ng/ml,最低定量限为2 ng/ml;该方法检测冻干甲肝减毒活疫苗、重组人白介素-2(IL-2)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人血白蛋白、小牛血清及健康人血清均无交叉反应;该方法检测3个浓度的HEV抗原内部参考品的回收率在95.13%～104.50%之间,试验内及试验间变异系数均<15%;包被抗HEV-IgY的酶标板于37℃放置5 d,其检测HEV抗原内部参考品的A450值及敏感性均未发生显著变化;3批HE疫苗成品中HEV抗原对氢氧化铝的吸附率均大于95%,符合相关质控要求。结论已成功建立了HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,可用于HEV抗原含量的检测。     

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法。方法制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶64,Westernblot分析显示,提纯抗体与Vero细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合。确定最佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1∶1000。Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0ng/ml时,线性关系良好,r=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好。将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义。结论已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法。     

第三批百日咳疫苗效力国家参考品的稳定性

第三批百日咳疫苗效力国家参考品（参苗＃３）是在１９８０年由中国药品生物制品检定所与长春生物制品研究所合作,制备并冻干而建立的。其效力单位经与ＷＨＯ的＃２、我国的＃２百日咳效力参考品标化,经过统计学处理得到其所标定的每安瓿１８个国际效力单位（ＩＵ／安瓿）。到目前为止,该批参考品从冻干之日起已有近２０年,为此,我们对该批百日咳疫苗效力国家参考品的稳定性进行了分析和研究。 第三批百日咳疫苗效力国家参考品在不同年代和不同的半数致死量（ＬＤ５０）攻击的条件下,按照中国生物制品规程（１９９５年版）规定的百日…     

冻干甲乙型肝炎联合疫苗组分相容性的研究

目的研究冻干甲乙型肝炎联合疫苗组分的相容性。方法将所制备的联合疫苗与同批单价甲型肝炎减毒活疫苗及重组乙型肝炎疫苗进行甲肝病毒滴度和乙肝疫苗效力检测,同时分别以联合疫苗与甲型肝炎减毒活疫苗及重组乙型肝炎疫苗接种恒河猴,检测甲肝抗体和HBsAb阳转率。结果该联合疫苗与同批单价疫苗的甲肝病毒滴度和乙肝疫苗效力及诱导猴体的甲肝抗体和HBsAb阳转率差异均无显著意义。结论冻干甲乙型肝炎联合疫苗组分间无拮抗作用,具有相容性。     

第6代百日咳疫苗效力国家标准品的建立

目的建立第6代百日咳疫苗效力国家标准品。方法选用百日咳菌株(沪64-21),发酵罐培养,收获的百日咳菌液经脱毒灭活后,分装冻干,作为备选品,按《中国药典》三部(2010版)进行无菌试验、血清学试验、水分含量及百日咳特异性毒性检测。以WHO标准品PWIS和中国百日咳疫苗效力国家标准品3号、5号为标准,经5个实验室进行协作标定,并考察其效力稳定性。结果该备选标准品的各项检测指标均符合国家标准品的规定;经协作标定45次,分别以国家标准品3号、5号和WHO标准品为标准进行量值溯源,标定结果差异无统计学意义(P>0.05);最终合并效价为13 IU/ml(95%CI=12.23～13.26 IU/ml);保存期内标准品的效力稳定。结论该备选标准品各项指标均符合要求,可作为新的第6代百日咳疫苗效力国家标准品使用。     

乙型脑炎灭活疫苗效力参考品的制备及稳定性

目的　制备乙型脑炎灭活疫苗国家效力参考品。方法　按《中国生物制品规程》要求制备乙型脑炎灭活疫苗原液 ,经超滤处理后加入冻干保护剂 ,制成冻干参考品并进行检测标定。结果　经检测 ,效力参考品外观、水分、无菌试验、效力试验均合格 ,稳定性好 ,且T值可保持在较高水平。结论　该批乙型脑炎灭活疫苗效力参考品可作为国家效力参考品     

狂犬病病毒抗原ELISA检测方法的建立及其应用

目的建立狂犬病病毒抗原ELISA检测方法,并进行初步应用。方法采用狂犬病病毒CTN-1V纯化抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,作为酶标抗体,马抗狂犬血清纯化抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法。对该方法进行验证,检测狂犬病病毒原液毒力和疫苗效力,并与小鼠(NIH)法检测结果进行对比。结果双抗体夹心ELISA检测方法的最低检出限为0.17 IU/ml,最佳线性范围为0.17～2.00 IU/ml,相关系数R>0.97;批间及试验内变异系数均小于10%,特异性、稳定性均良好;检测20批病毒原液毒力及疫苗效力,结果与NIH法相比,差异无统计学意义。结论已建立狂犬病病毒抗原ELISA检测方法,可用于生产过程中狂犬病疫苗原液和半成品的检定。     

狂犬病病毒抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立狂犬病病毒(Rabies virμs,RV)抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,以应用于疫苗生产过程中RV含量的监测。方法将RV aGV株纯化抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备抗RV单克隆抗体,纯化后以HRP进行标记,建立双抗体夹心ELISA检测方法。以狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品为定量标准,建立剂量-反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的专属性、精密性及适用性进行验证。结果制备了2株针对不同抗原位点的单克隆抗体1E9和2H1,间接ELISA法测定腹水效价为1∶105～1∶107,纯化后蛋白含量分别为10.285和7.64 mg/ml。建立的ELISA法对RV抗原的最低检出限为1.03 mIU/ml,标准曲线的最佳线性范围为1.03～66 mIU/ml,相关系数为0.991 9。该方法对检测过程中可能遇到的杂质和添加物(人血清白蛋白、牛血清、Vero细胞培养上清)的检测结果均为阴性;检测3个浓度(20、12.50和3.13 mIU/ml)狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品的试验内和试验间变异系数的平均值分别为7.78%和14.0%;用该方法检测不同毒株、不同细胞生产的狂犬病疫苗的RV抗原含量的平均值在0.67～4.86 IU/ml之间。结论成功建立了RV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,可对来自不同毒株、不同细胞的狂犬病疫苗的RV抗原进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

第5批百日咳疫苗效力国家标准品的建立

目的　建立第 5批百日咳疫苗效力国家标准品。方法　选用百日咳菌株 (编号 5 80 0 4 ) ,采用B G培养基固体培养 ,将培养的百日咳菌液经脱毒灭活后分装冻干。以WHO的效力标准品 # 3和中国效力标准品 # 4为标准进行协作标定。结果　该标准品经 7个实验室协作标定 6 3次 ,最终合并效价为 14IU ml(95 %CI=13 10 9～15 32 0 )。结论　第 5批百日咳疫苗效力标准品各项指标均符合要求 ,可以作为新的国家百日咳效力标准品使用 ,效价拟定为 14IU ml。     

不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及稳定性

目的观察不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及其稳定性。方法配制12批不含硫柳汞的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞),观察其免疫原性及在4、22和37℃保存不同时间的稳定性。结果该疫苗各项检测指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求,实验组与对照组的效价测定结果差异无显著意义。10μg/ml疫苗22℃放置6个月和4℃放置12个月效力均未下降;20μg/ml疫苗在37℃放置4周后,效力略有下降。结论为婴幼儿提供了一种更加安全有效的重组乙型肝炎疫苗。     

酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立

目的建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据。方法制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性。以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法;梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证。结果共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7%,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合;酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25～200 ng/ml的范围内,线性关系良好(R2>0.99),最低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好;检测不同浓度的抗原回收率为97.6%～107.00%,变异系数均<10%,最低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率。结论成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测。     

吸附无细胞百白破联合疫苗的渗透压分析

目的分析吸附无细胞百白破联合疫苗(DTaP)的渗透压摩尔浓度,为规程修订提供参考。方法采用《中国药典》(三部)2010版收录的冰点下降法,随机抽取1批DTaP,检测渗透压摩尔浓度,对方法进行重复性和中间精密度验证。采用该方法检测DTaP、冻干和液体剂型b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗以及DTaP-Hib联合疫苗的渗透压摩尔浓度,测定DTaP氯化钠含量,并进行相关性分析。结果在相同条件下,同一人多次检测结果及同一天不同人和同一人不同检测日期的检测结果组内RSD值均在2%以内,表明该方法重复性及中间精密度较好;DTaP的渗透压摩尔浓度在255²84 mOsmol/kg之间,与液体剂型Hib疫苗较接近,DTaP-Hib的渗透压摩尔浓度为545 mOsmol/kg,为冻干剂型Hib与DTaP渗透压值的叠加;DTaP氯化钠含量在8.2284 mOsmol/kg之间,与液体剂型Hib疫苗较接近,DTaP-Hib的渗透压摩尔浓度为545 mOsmol/kg,为冻干剂型Hib与DTaP渗透压值的叠加;DTaP氯化钠含量在8.2⁹.2 g/L之间;渗透压摩尔浓度和氯化钠含量除1批在M±3 SD范围内,其他检测值均在M±2 SD范围内,其相关系数达0.70,相关性较强。结论渗透压摩尔浓度测定可替代氯化钠含量测定,作为考察DTaP渗透压批间一致性的指标。     

狂犬病病毒抗原定量检测方法的建立

目的建立狂犬病病毒抗原的定量检测方法,用于疫苗生产过程中病毒含量的监测。方法用狂犬病病毒aG株免疫豚鼠,制备抗狂犬病病毒多克隆抗体,纯化后以辣根过氧化物酶进行标记。采用双抗体夹心ELISA法建立检测系统。以狂犬病疫苗国家参考品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的精密性、特异性和适用性进行验证。结果制备的多克隆抗体高峰效价为1∶105,纯化后的抗血清蛋白含量为6.45mg/ml。建立的ELISA方法对狂犬病病毒抗原的最低检出量为5.3mIU/ml,最佳定量区间为10～110mIU/ml,相关系数为0.9983,精密性和特异性较好。用该方法对狂犬病疫苗进行抗原定量,与NIH法测定的疫苗效力具有一定的相关性;检测市售的不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗,其结果在2.4～9.9IU/ml之间。结论已建立了狂犬病病毒抗原的定量检测方法,可对来自不同毒株和不同细胞系的狂犬病疫苗进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)冻干保护剂的筛选

目的筛选适用于冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的冻干保护剂。方法用同一批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液在同一冻干条件下,改变右旋糖酐40、海藻糖及人血白蛋白3种保护剂主要成分的含量,组合成6种保护剂配方,分别制备成半成品。冻干后检测成品外观、疫苗效力及热稳定性,确定最佳冻干保护剂配方。以最佳保护剂配方制备6批成品进行适用性验证,并选择3批成品进行长期稳定性验证。结果确定最佳冻干保护剂的配方为4%海藻糖、3%右旋糖酐40、1%蔗糖、0.5%甘露醇、2%人血白蛋白。以该配方制备的6批成品的各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)的要求,其中3批成品经2~8℃保存12个月后的效价较稳定。结论筛选获得了最佳冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的冻干保护剂,且具有良好的稳定性。     

冻干参数对疫苗质量的影响

目的分析冻干参数对疫苗质量的影响,为进一步优化疫苗的冻干工艺、保障产品质量提供参考。方法取乙型脑炎减毒活疫苗半成品,分为4组,每组10批次,采取不同的保温温度及保温时间进行冷冻干燥,检测冻干疫苗的病毒滴度、残余水分及外观,分析不同的冻干保温温度和时间对疫苗质量的影响。结果 4组各10批冻干疫苗的病毒滴度均在5.7 lg PFU/ml以上;水分含量均低于3%的标准要求,疫苗外观均能达到本公司质量标准。以(23±1)℃冻干10 h对疫苗的综合影响最小,(24±1)℃冻干10 h对疫苗病毒滴度的影响最大,而冻干疫苗中的残余水分随冻干时间的延长而降低。结论冻干参数对疫苗质量存在明显的影响,特别是温度和时间参数,温度低有利于疫苗活性的保护,温度高有利于水分的干燥;时间短有利于疫苗的活性,时间长有利于水分的干燥。因此,在保证外观的前提下,应综合验证冻干条件对不同疫苗的影响,采取合适的冻干时间和温度,以保障疫苗质量。     

聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗的研制

目的研制安全有效的不含人血白蛋白稳定剂的风疹减毒活疫苗。方法将风疹减毒活疫苗毒种RA27/3株按适当比例接种单层人二倍体细胞MRC-5株,使用无血清、无蛋白的CDM培养基培养病毒,收获病毒液,加入聚乙烯吡咯烷酮作为病毒稳定剂,制备疫苗原液,加入冻干保护剂,制备5批冻干疫苗,进行各项检定。另取1批原液样品,分别加入聚乙烯吡咯烷酮和人血白蛋白作为病毒稳定剂,制成疫苗,进行各项检测。结果5批疫苗各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。同1批原液制备的聚乙烯吡咯烷酮与人血白蛋白稳定剂疫苗的病毒滴度和热稳定性无明显差异。37℃放置6周,两种稳定剂疫苗的病毒滴度均为3.63LgCCID50/ml。结论聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗质量符合《中国药典》三部(2005版)的要求。