病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

全球主要产地雪茄烟叶的风味特征初探

  目的   为雪茄卷烟工业原料调配、产品设计和雪茄烟叶种植区划提供技术依据。  方法   以全球17个（国内10个,国外7个）主要雪茄烟叶产地烟叶样品为材料,对其风味类型和风味强度进行感官评吸,从地理位置角度分析了纬度与风味的关系。  结果   （1）风味类型:全球17个雪茄产地烟叶样品共包含8种风味类型,其中共有风味类型有5种,不同产地所特有的风味类型有3种。（2）风味强度及风味浓度:国内,海南昌江烟叶共有5种风味强度表现最优,且风味浓度值最高。国外,古巴共有6种风味强度表现最优,且风味浓度值最高。此外,进口雪茄烟叶样品在植物风味、香料风味、泥土风味、其他风味以及风味浓度等5个方面的均值显著高于国产烟叶。（3）纬度与风味浓度:Ⅲ区（17°88′~26°74′）>Ⅰ区（0°14′~9°01′）>Ⅱ区（9°01′~17°88′）> Ⅳ区（26°74′~35°61′）。  结论   国内外雪茄烟叶产地中分别以海南昌江产地和古巴产地的雪茄烟叶风味特征最为突出,且古巴雪茄烟叶风味特征高于海南昌江。产地的地理纬度是影响雪茄烟叶风味特征的主要因素。      

云南省烟草正番茄斑萎病毒属病毒的调查和鉴定

  背景和目的  烟草是云南省支柱产业,近年来烟草斑萎类病害发生严重。了解烟草斑萎类病害在云南的病原种类、病害发生、流行和分布势在必行。  方法  2012以来,本课题组从云南省10个地州市共采集疑似Orthotospovirus属病毒侵染的烟草样品38份,采用症状学观察、酶联免疫吸附反应以及RT-PCR鉴定。  结果  结果显示有20份烟草样品感染Orthotospovirus属病毒,其中番茄斑萎病毒单独侵染样品11份、朱顶红褪绿环斑病毒单独侵染样品4份、番茄环纹斑点病毒单独侵染样品2份、马蹄莲褪绿斑病毒单独侵染样品2份、番茄斑萎病毒和朱顶红褪绿环斑病毒复合侵染1份。  结论  本研究首次报道朱顶红褪绿环斑病毒侵染烟草,同时发现番茄斑萎病毒和朱顶红褪绿环斑病毒复合侵染烟草,鉴定结果对于科学制定烟草斑萎病害综合防治措施,保障云南省烟草种植业的持续健康发展具有重要意义。      

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

国内外雪茄烟专利技术研究热点及趋势分析

  背景和目的  为使我国烟草行业相关科技人员准确把握雪茄烟的专利申请现状、研判今后的发展趋势。  方法  依托国家知识产权局和德温特专利平台对2009—2018年度在全球申请的657件相关专利进行统计分析。  结果  1)雪茄烟专利的地域集中度相对较高,专利主要分布在美国和中国大陆等地,与当前雪茄烟的市场分布情况较为一致,其次是欧盟和法国。国外个人、国外其他单位以及国内烟草行业是该领域的创新主体,但具体专利权人的集中度并不高,以BLUNT WRAP,U.S.A.,INC的专利数量最多,其次是四川中烟、湖北中烟和重庆中烟等国内工业企业。2)雪茄烟专利申请主要集中在A24F(吸烟者用品,主要为配件)小类,其次是B65D(雪茄贮存或运输容器)、A24C(雪茄机械)、A24B(加工方法)和A24D(烟支结构设计)小类;而外观设计专利主要集中在27-06小类。在具体技术领域,专利申请主要分布在配件和外观设计两个方面。3)国内申请人(含国内烟草行业)在外观设计方面的专利申请略显不足。  结论  综合考虑专利保护的地域性以及国外申请主体在中国的专利布局率相对较低等情况,对于海外专利的跟踪、研究以及积极开展相关专利的海外布局战略等方面,国内烟草行业有待加强。      

雪茄种植户的农机使用情况对其雇工的影响研究——基于四川什邡烟农调研数据

  目的  探究雪茄种植户的农机使用情况与雇工行为的关系, 以指导雪茄烟农业生产。  方法  首先对烟叶种植中的机械和劳动力使用的变迁进行回顾分析,再以四川什邡的雪茄烟农调查数据为基础,运用二元Logit模型和因变量受限Tobit模型分析雪茄种植户农机使用对其雇工行为的影响。  结果  ① 近15年来烟田亩均投入的租赁作业费、机械作业费、人工成本持续上升,印证了烟草种植劳动与资本“双密集”的特征。②在以小规模家庭经营为基础的雪茄烟叶种植模式下,农机的使用并未明显替代人工投入,反而对雪茄种植户雇工有正向显著的影响。③是否加入合作社、种植规模、家庭外出打工成员情况对小规模农户农业雇工也有正向显著的影响,而种植经验、是否为生产组长、购买农业保险则对农业雇工呈现负向显著影响。  结论  雪茄种植过程中使用农业机械能够显著提高雇工概率,这是种植过程中机械与人工环节的不完全替代性以及种植规模扩大的结果,同时雪茄种植户不能仅靠使用农机来提高生产效益,需要进一步优化生产组织模式来提质增效。      

不同类型晾晒烟种质资源的化学成分和几种致香成分分析

  目的  筛选品质优良的晾晒烟种质资源。  方法  35份晾晒烟种质资源种植于云南省玉溪市研和镇,取经晾晒调制后的中部烟叶,经相关分析和聚类分析比较其常规化学成分和淀粉、多酚、石油醚提取物、多元酸、高级脂肪酸等成分含量。  结果  各主要成分含量范围(及最高值类别):总氮1.62%~3.44%(晒烟)、烟碱2.30%~9.76%(晒烟)、钾0.73%~3.42%(黄花烟)、多酚1.51%~6.43%(晒烟)、石油醚提取物2.66%~8.94%(雪茄烟)、草酸7.09 mg/g~50.21 mg/g(晒烟)、苹果酸41.97 mg/g~173.39 mg/g(黄花烟)、柠檬酸16.02 mg/g~126.45 mg/g(黄花烟)等。35份晾晒烟种质可聚为5类:第1类为黄花烟资源,钾、苹果酸、柠檬酸等含量高;糖、酚、石油醚提取物、草酸、丙二酸等含量低;第2类有马里兰烟、晒烟和雪茄烟,其石油醚提取物含量高,苹果酸和柠檬酸等含量较高;第3类多为晒烟,多酚含量高;第4类总氮、烟碱含量高,草酸含量较高,第5类总糖、还原糖、淀粉等含量高,两糖差、糖碱比、氮碱比高,苹果酸、柠檬酸等含量低。      

16个雪茄烟品种的烟碱转化率及与发酵后烟叶TSNAs含量的关系

  目的  明确不同雪茄烟品种烟碱转化率差异及与烟草特有亚硝胺(TSNAs)含量的关系。  方法  对16个雪茄烟品种的中部叶生物碱、硝酸盐和TSNAs含量进行了测定,并分析了其相关关系。  结果  1) 不同品种雪茄烟叶均存在烟碱向降烟碱的转化问题,参试的16个品种烟碱含量变化范围为1.14%~5.42%,平均为3.02%,降烟碱含量的变化范围为0.11%~1.47%,平均值0.40%,烟碱转化率范围为5.03%~53.12%,平均值为12.66%,品种间烟碱转化率的变异系数高达101.01%。2)茄衣品种的降烟碱含量和烟碱转化率平均值显著高于茄芯品种。3)不同雪茄烟品种烟叶中的TSNAs含量和组成具有显著差异,总TSNAs含量的变化范围为181.74 ng/g~7759.1 ng/g,平均为3010.98 ng/g,以NNN含量最高,且变异性最大,其平均值为1616.59 ng/g,变异系数为97.28%。4)相关分析结果显示,参试的16个品种的雪茄烟叶中降烟碱含量、烟碱转化率都与NNN和TSNAs含量呈极显著的正相关关系,NNN与降烟碱含量的相关系数为0.802。  结论  烟碱转化导致降烟碱含量增高是造成雪茄烟叶中NNN含量和总TSNAs含量增加的主要原因之一。      

烟草青枯病发病烟株根际土壤细菌群落分析

  目的  研究青枯病发生对根际土壤细菌群落组成的影响, 探明影响根际土壤细菌群落的环境因子。  方法  采用宏基因组学高通量测序技术, 比较发病烟株和健康烟株根际土壤细菌群落差异。  结果  (1) 健康烟株根际土壤细菌Ace指数、Chao指数和Shannon指数有高于发病烟株的趋势, 而Simpson指数有低于发病烟株的趋势; (2)发病烟株根际土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)等益生菌减少, 而劳尔氏菌属(Ralstonia)和Rudaea等病原菌增加; (3)土壤pH、有效磷(AP)、交换性钙(Ca)和有效铜(Cu)含量在发病烟株根际土壤中显著减少, 而速效钾(AK)含量显著增加。  结论  与健康烟株根际土壤相比, 发病烟株根际土壤细菌多样性、有益菌丰度、土壤pH和养分含量都较低; pH、P、K、Ca、Cu是对根际土壤细菌群落影响较大的土壤环境因子。      

CMV-IB侵染诱导烟草内质网应激

病毒复制产生的大量病毒蛋白阻碍寄主细胞转运功能,未/错折叠蛋白在内质网腔蓄积导致内质网应激(ER stress)。为明确利用液泡膜复制的黄瓜花叶病毒(CMV)是否诱导寄主ER stress,在CMV-IB侵染三生烟和本氏烟体系中,通过qRT-PCR检测ER stress相关基因的转录水平,农杆菌介导ER marker(m Cherry-HDEL)瞬时转染后激光共聚焦显微观察ER形态,电镜观察细胞病理。结果显示,较PBS对照,接种CMV后12 h,ER stress相关基因的转录水平显著上调1.23~7.37倍;5~10 d ER膜微丝发生明显的重排和增生;病变细胞叶绿体降解、线粒体肿胀,且沿液泡膜的微自噬和细胞质中的巨自噬结构增多。表明CMV侵染通过激活ER stress基因和改变ER膜形态诱导寄主ER stress,寄主细胞会以细胞器降解、自噬乃至凋亡的方式抵御病毒扩展。     

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

海南雪茄烟叶霉变微生物鉴定及拮抗菌株筛选

为明确引起海南雪茄烟叶霉变的微生物种类并筛选其拮抗菌株防治烟叶霉变,分别从海南霉变雪茄烟叶表面分离、纯化得到霉变微生物和拮抗微生物,采用形态学和分子生物学相结合的方法鉴定微生物种类。鉴定和筛选结果表明,引起海南雪茄烟叶霉变的微生物主要为篮状菌属、帚霉属和曲霉属,得到3株霉变菌株分别为Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus。筛选到2株拮抗效果良好的拮抗菌株,分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）。引起海南雪茄烟叶霉变的微生物主要为篮状菌属、帚霉属和曲霉属菌株,筛选到的2株芽孢杆菌对致霉菌有良好的拮抗作用,为雪茄烟叶霉变的防治提供了参考。     

不同规格育苗盘对雪茄烟苗生长和膜上移栽烟叶产质量的影响

为了筛选能培育适合膜上移栽方式的高素质雪茄烟苗的湿润育苗盘,试验研究了50孔、54孔、70孔、72孔和100孔5个规格育苗盘对烟苗生长和膜上移栽烟株大田生长及烟叶产量、经济效益的影响。结果表明,50孔和54孔育苗盘所育烟苗农艺性状、根系形态指标、鲜干质量、壮苗指数较高,大田烟叶生长较快,但烟叶产量、茄衣烟叶产量较低,育苗投入成本明显增加,烟叶经济效益降低。72孔育苗盘所育烟苗素质整体较高,烟株大田长势好,烟叶产量、茄衣产量、茄衣产出率均较高,其中茄衣产出率较烟苗素质高的50孔处理提高9.92%,烟叶经济效益较育苗投入最高的50孔处理提高8.28%。70孔育苗盘所育烟苗的根冠比、壮苗指数与72孔处理差异不显著,但其大田烟叶产量、茄衣烟叶产量却显著低于72孔处理。而100孔育苗盘所育烟苗素质尽管低于其他处理,但其大田烟叶产量、茄衣产量最高,分别较最低的54孔处理提高15.42%、28.43%,育苗投入成本最低,烟叶经济效益较50孔处理提高12.06%。因此,72孔和100孔苗盘可用于海南雪茄烟叶秋季湿润育苗,其所育烟苗适合雪茄烟叶膜上移栽使用。     

不同烟草群体间遗传多样性分析

利用SRAP标记对81份烟草种质进行遗传多样性分析,根据种性来源将81份种质材料分为黄花烟地方种质、普通烟草地方种质、选育种质以及引进种质四个群体.结果表明:(1)从160对引物组合中筛选出17对扩增带清晰、重复性和多态性好的引物用于81份烟草种质资源遗传多样性研究,共检测到163个位点,其中123个位点具有多态性,多态性比例为75.5%,平均每个引物检测到10个位点.遗传多样性指数(Nei's)和Shannon's指数分别为0.41和0.57,种质间遗传相似系数变异范围在0.11～0.99之间,说明我国烟草种质资源中存在着丰富的遗传变异. (2)四个群体遗传差异由大到小分别为:黄花烟地方种质>普通烟地方种质>引进种质>选育种质.(3)聚类分析可将81份种质材料划分为黄花烟草和普通烟草2大类群,烤烟、晒晾烟、白肋烟、雪茄烟以及香料烟五种栽培类型之间没有明确的界线;聚类分析和主坐标分析计算结果表明,黄花烟地方种质与其它三个群体的遗传距离较远,表明目前在我国烟草育种中对黄花烟的利用较少.引进种质和选育种质群体间遗传相似系数为0.99,说明目前我国烟草育种中较多利用引进种质,对具有丰富遗传变异的地方品种利用较少,育种亲本遗传基础狭隘.     

烟草根细胞原生质体的制备

根细胞是植物单细胞多组学研究的重要材料,烟草作为重要的模式生物之一,其根细胞原生质体的高效分离也越来越重要。为了获得产量和活性较高的烟草根细胞原生质体,以本氏烟草和栽培烟草K326为材料,采用酶解法制备了烟草根细胞原生质体,同时优化了影响原生质体分离纯化的酶解液组合、酶解时间和酶解渗透压等条件,并通过显微镜观察和台盼蓝染色鉴定其活性。结果表明：(1)以1.5%纤维素酶+1.5%果胶酶+0.4 mol/L甘露醇的酶解液组合,经过2h酶解、500 r/min离心10 min得到的根尖细胞原生质体产量和活性相对较高;(2)最终获得了活性大于70%、数量达到105数量级的较高质量烟草根原生质体。     

抗TMV普通烟中N导入片段的特异分子标记开发与交换单株筛选

  背景和目的  N导入片段赋予烟草品种对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）抗性,但同时带来产量低等连锁累赘,为了筛选减少连锁累赘的交换单株。  方法  以普通烟草中的N导入片段为材料,利用茄科作物基因组序列数据和比较基因组学方法,开发了特异扩增N导入片段的系列分子标记,通过分子标记在种质资源和分离群体中筛选交换单株。  结果  开发出23个N导入片段特异的分子标记,将携带N导入片段的普通烟种质划分为Coker176、Samsun NN和Xanthi nc三种长度类型。供试90份抗TMV的普通烟资源中,85份属于N导入片段长度相对较短的Coker176类型,未发现比Coker176更短的种质资源。利用N导入片段末端分子标记TN5.51,从不含N基因的K326、Y87、5F、HD与Coker176配置的4个回交分离群体的22572株抗TMV单株中,筛选到11株N导入片段交换单株,Coker176类型的N导入片段在普通烟中的交换频率为0.049%。其中24-8H等3个单株的N导入片段缩短约一半,具有减少连锁累赘的潜力。  结论  本研究获得了普通烟中N导入片段的系列分子标记和长度缩短一半的交换单株,为解析N导入片段连锁累赘的分子机理、减少连锁累赘奠定了基础。      

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

新鉴定高抗TMV普通烟草枯斑资源的N导入片段长度多样性

为了解我国普通烟草（Nicotiana tabacum）资源对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的抗性基因状况,为烟草抗病育种的亲本选择提供信息,利用N基因特异分子标记鉴定出携带N基因的普通烟草资源,并采用N导入片段的特异分子标记鉴定了N导入片段的长度。结果表明,供试的63份接种TMV表现枯斑的普通烟草（简称普通烟草枯斑资源）可划分为3大类型,分别为Coker176类型:GL3.50和GL4.06标记阴性、TN4.39、TN5.226、TN5.51标记阳性;Samsun NN类型:GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226标记阳性,TN5.51阴性;Xanthi nc类型:GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226、TN5.51标记阳性。402等51份资源的N导入片段长度属于Coker176类型,Ky160等2份资源的N导入片段长度属于Samsun NN类型。Ky52等10份资源的N导入片段长度属于Xanthi nc类型。N导入片段较短的枯斑资源,推测其连锁累赘可能较小,育种利用潜力较大。本文较系统地鉴定了普通烟草抗TMV的枯斑资源的N导入片段长度,可为抗TMV种质资源的育种利用提供参考。      

海南雪茄烟叶外观质量与化学成分的关系研究

为研究雪茄烟叶外观质量与化学成分之间的关系,对海南种植的巴西3号、古引4号、H211、D系和H382等5个不同品种（系）雪茄烟叶进行外观质量和数字化评价,利用统计学方法分析其与雪茄烟叶化学成分的关系。试验结果表明,不同品种雪茄烟叶中总植物碱含量、钾含量和碱糖比在化学成分差异中起主导作用;化学成分中总植物碱含量、钾含量、碱糖比、碱钾比与外观质量指标的身份、油分和成熟度的相关性达到极显著水平;叶片结构与钾含量和碱糖比的相关性达到显著水平。回归分析结果表明,雪茄烟叶品种和外观质量指标的身份、油分可以较好地反映烟叶中总植物碱含量、碱钾比、氯离子含量的变化。