苯丙氨酸解氨酶(PAL)的研究进展

对苯丙氨酸解氨酶的分布、特点进行了概括,并分别对植物、微生物苯丙氨酸解氨酶的研究情况进行了综述。重点介绍了生产苯丙氨酸解氨酶的微生物选育方法以及提高酶活性、酶稳定性的研究进展,旨在为该酶的进一步研究提供参考依据。      

苯丙氨酸解氨酶(PAL)的研究进展

对苯丙氨酸解氨酶的分布、特点进行了概括,并分别对植物、微生物苯丙氨酸解氨酶的研究情况进行了综述.重点介绍了生产苯丙氨酸解氨酶的微生物选育方法以及提高酶活性、酶稳定性的研究进展,旨在为该酶的进一步研究提供参考依据.     

苯丙氨酸解氨酶的研究进展

对苯丙氨酸解氨酶的分布、基本特性、分子结构、各种因子对其活性的影响和生理功能方面作了简要的概述,旨在为该酶的进一步研究提供参考。     

L-苯丙氨酸解氨酶产生菌分离及酶促反应研究

从土壤中分离出具有较高活力的苯丙氨酸解氨酶产生菌株——酵母菌SAl。对其酶的诱导合成以及转化肉桂酸生产L-苯丙氨酸条件进行了优化。结果表明，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸作为诱导物及联合使用均能提高L-苯丙氨酸解氨酶的酶活力单位，其中L-酪氨峻的诱导性最好：最佳酶促反应条件为：2．0％反式肉桂酸，碳酸氢铵：氨水（W：V）=4：4，pH10．6，34℃，反应时间8h；往转化体系中添加甘油对酶活力有较好的保护作用。     

冬枣果实苯丙氨酸解氨酶酶学特性的研究

研究了冬枣果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶学特性。L-苯丙氨酸为枣果实PAL的反应底物,结果表明,最适底物浓度为1.0 mmol/L。枣果实PAL属于别构酶,具有2个米氏常数,Km分别为0.115×10-4、8.177×10-4 mol/L。枣果实PAL最适温度为50℃,最适p H为8.8。在浓度为0~4.0 mmol/L范围里,L-半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸均对枣果实PAL活性有一定的抑制作用,而抗坏血酸和蔗糖对PAL有激活作用。金属离子对PAL激活作用由强到弱依次为:Cu2+Fe3+Fe2+Na+;金属离子对PAL抑制作用由强到弱依次为:Al3+Mg2+Mn2+Ca2+Zn2+K+。研究结果揭示了冬枣果实PAL酶学特性,为通过调控枣果实PAL酶活性改善果实贮藏特性提供了理论依据。     

植物苯丙氨酸解氨酶的生物学研究进展

苯丙氨酸解氨酶(phenylanlanine ammonialyase,PAL, E.C.4.3.1.5)作为植物次生代谢特别是苯丙烷途径的关键酶,与植物抵抗病原菌入侵有密切关系,具有重要的植物生理意义.本文综述了植物PAL的存在与分布、分子结构、酶学性质和作用机制,应用酶学和分子生物学知识阐述了其表达调控机理,并在基因水平上对PAL的分子生物学研究进行了展望,旨在为今后PAL在植物抗病应用上提供基础数据.     

重组大肠杆菌产苯丙氨酸解氨酶(PAL)发酵条件研究

本文对重组大肠杆菌产苯丙氨酸解氨酶的发酵条件和补料培养工艺进行了研究。摇瓶培养条件下,重组菌生长和产酶的最适初糖浓度为10g/L,酵母膏的最适添加量为5g/L,培养基最适初始pH值为7.5。采用10L发酵罐对该菌进行指数流加培养,24 h细胞干重达到到82.4 g/L,产酶量达到3477U/L,比摇瓶培养最好结果分别提高了14.2和11.2倍。     

苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量和活力,对高效表达圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM109进行培养,优化了发酵培养基成分、培养条件以及发酵工艺,结果表明,最佳葡萄糖浓度为20 g/L,碳氮比为7.86,添加5 g/L酵母粉和蛋白胨有利于菌体产酶,最佳发酵液初始pH为7.5,接种量为10 %.通过以上优化,重组大肠杆菌培养18 h时酶活可达到70 U/g(DCW),酶活比原工艺提高了1.6倍.     

山药苯丙氨酸解氨酶特性的研究

本文研究了山药苯丙氨酸解氨酶(PAL)的动力学特性。结果表明,PAL最适底物浓度为1mmol/L,底物浓度过高或过低都对酶活力不利。PAL在硼酸-氢氧化钠缓冲液中适宜的pH范围为7.6～9.2,最适pH有2个:pH8.0和pH8.8。PAL不耐酸碱,尤其不耐碱。PAL适宜的温度范围为35～55℃,最适反应温度为45℃,超过70℃则容易钝化。L-酪氨酸和L-半胱氨酸对PAL活性都有抑制作用,抑制程度随抑制剂浓度增加而增强。L-酪氨酸的抑制作用较强,是PAL的竞争型抑制剂。L-胱氨酸对PAL的活性无影响。     

荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶特性的研究

研究了荔枝果肉中苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL）的酶学特性。荔枝PAL动力学曲线并不遵循米氏方程,其最适底物浓度为2 mmol/L。在硼砂-硼酸缓冲液中,荔枝PAL的最适反应p H为8.7。PAL不耐酸碱,尤其不耐酸。荔枝PAL的最适反应温度为45℃,高于75℃则易于钝化,具有较强的耐热性。L-酪氨酸和L-半胱氨酸对荔枝PAL均有明显的抑制作用;金属离子中,Fe2+和Fe3+对荔枝PAL活性具有明显的促进作用,而Ca2+、Cu2+、Co2+、Ag+离子则对其活性有明显的抑制作用。      

苦荞类异黄酮还原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到类异黄酮还原酶基因(IRL)的开放阅读框序列(ORF),命名为FtIRL。序列分析表明：FtIRL含一个长942bp的ORF,编码313个氨基酸,其氨基酸序列与金荞异黄酮还原酶FcIFR (GenBank登录号ABV02071)同源性最高,达到97%;与其他植物IRL同源性为44%～73%。生物信息学分析表明：FtIRL推导的蛋白质含有典型的底物结合口袋和保守的NADPH结合位点,符合短链脱氢酶家族的结构特征。构建基于氨基酸的系统发育树表明,苦荞FcIFR虽然在氨基酸序列上与其他植物的异黄酮还原酶(IFR)有较高的同源性,但其生物学功能可能更接近落叶松脂醇还原酶(PLR)。     

底物和产物对鲜切山药苯丙氨酸解氨酶活性的影响

本实验以山药为材料提取苯丙氨酸解氨酶(PAL),研究底物和产物对山药PAL活性的影响。结果表明:苯丙氨酸促进PAL活性,PAL最适底物浓度为200mg/L,底物浓度过高或过低对酶活力都不利;反式肉桂酸抑制PAL活性,最强抑制浓度为120mg/L,高于或低于这个浓度抑制作用减弱;阿魏酸抑制PAL活性,最强抑制浓度为40mg/L,之后随浓度增加抑制作用减弱,浓度增加至100mg/L时抑制作用最弱,以后随浓度增加抑制作用又增强。     

苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（Dfr）的克隆及序列分析

采用同源基因克隆的方法,以苦荞和甜荞叶片为材料,提取总RNA,经RT-PCR 扩增获得其二氢黄酮醇4- 还原酶基因(dfr)cDNA 序列,并通过T 载体克隆后测序。序列分析表明,获得了苦荞和甜荞dfr 的全长cDNA编码序列,其1026bp 的全长开放阅读框(ORF)均编码341 个氨基酸,并具典型的dfr 结构特征和功能模块。同源性分析显示,苦荞和甜荞与其他植物的dfr 基因核苷酸相似性为71%～98%;根据氨基酸序列构建系统进化树表明,二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。     

树莓RiPAL1基因克隆及生物信息学分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase,PAL）是苯丙烷类代谢的关键酶,能调节树莓中黄酮类的生物合成。为了深入研究树莓中RiPAL1基因的功能与调控机制,以树莓果实为材料提取总RNA,合成cDNA第一链,然后成功克隆出树莓果实RiPAL1基因,并对其进行了相关的生物信息学分析。结果表明,RiPAL1基因的编码序列（Coding Sequence,CDS）全长为2 133 bp,编码710个氨基酸,分子量为77.50 ku,等电点为6.21。RiPAL1蛋白疏水性最大值为4.50,最小值为-4.50,平均疏水指数为-0.49,为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽。含有4个N糖基化位点和67个特异性激酶位点,二级结构以α螺旋为主,三级结构为同型四聚体。多序列比对显示RiPAL1蛋白具有典型的苯丙氨酸解氨酶保守结构域,系统进化分析表明RiPAL1蛋白与同科植物草莓亲缘关系最近。该研究可为深入研究RiPAL1基因参与树莓果实黄酮类物质生物合成的分子机制提供参考。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。     

迟钝爱德华氏菌FimA基因的克隆及序列分析

以迟钝爱德华氏菌Et、XA、EA分离株的DNA为模板,采用PCR技术,扩增菌毛亚基(FimA)基因的DNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:Et、XA、EAFimA基因由534个核苷酸组成,编码177个氨基酸。Et、XA、EA之间FimA基因核苷酸同源性为99%,与其它分离物核苷酸同源性为76%～77%,氨基酸同源性为81%～82%。     

金褐链霉菌SYAU0709中AURJ3M基因的克隆和序列分析

以金褐链霉菌SYAU0709的DNA为模板,根据GenBank中公布的PimM的序列设计引物,通过PCR扩增方法从金褐链霉菌中扩增出约579bp的目的片段。将PCR产物克隆至PMD19-T Vector中,通过PCR扩增及测序分析发现,金褐链霉菌SYAU0709来源的AURJ3M基因和纳塔尔链霉菌PimM基因的序列具有95%的相似性。通过摇瓶发酵显示AURJ3M基因能促进金褐霉素的生物合成。     

Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) Grain and Fractions: Antioxidant Compounds and Activities

Abstract: Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) is an alternative crop belonging to the Polygonaceae family. In comparison to antioxidant activity of frequently used cereals, buckwheat has been reported to possess higher antioxidant activity (AOA), mainly due to high rutin content. The objective of this work was to determine the main antioxidant compounds and AOA of buckwheat grain fractions (whole grain, hull, and groat). Buckwheat grain fractions were extracted with ethanol/water (80/20, v/v), followed by determination of total phenolic and flavonoid content. Quantification of phenolic compounds and tocopherols was performed by high‐performance liquid chromatography (HPLC). The AOA was estimated by 2 direct electron spin resonance (ESR) and 4 indirect (spectrophotometric) tests. Significantly higher contents of total phenolics and total flavonoids were found in buckwheat hull than in whole grain and groat. Protocatechuic, syringic, and sinapic acid, rutin, and quercetin were found in all tested fractions, whereas vanilic acid was found in whole grain and hull. The content of total tocopherols in investigated samples ranged from 23.3 mmol/g for hull to 61.8 mmol/g for groat. Hull was superior in scavenging activity on 1,1‐diphenyl‐2‐picrylhydrazyl (DPPH^?), hydroxyl (^?OH), and superoxide anion (O₂^?‐) radicals, reducing activity, AOA by β‐carotene bleaching method, and chelating activity on Fe²⁺ as evidenced by its lower IC₅₀ value. Obtained results can broaden the utilization of buckwheat, especially a share of hull in whole grain flour production. Practical Application: Obtained results suggest possibility to supplement the whole grain buckwheat flour with hull, which leads toward better usage of by‐products in buckwheat production, and enhancement of antioxidant potential of the final product.