强烈炽热球菌几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成与结构分析

利用全基因合成方法合成了强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的几丁质酶编码基因并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现了可溶表达。利用该酶对低脱乙酰度壳聚糖进行水解并对获得的壳寡糖产物进行组成及结构分析。分子排阻高效液相色谱结果显示,水解产物相对分子质量分布范围为1?000～5?000。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度2～9、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振对酶解产物壳寡糖的结构鉴定结果显示,所有寡糖组分的还原端均主要由两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖组成。综上,本研究利用来源于强烈炽热球菌的几丁质酶制备了还原末端结构确定的低脱乙酰度壳寡糖,为复杂结构壳寡糖结构与功能关系研究提供了理论支持。     

聚合度为6～8的壳寡糖的制备

目的研究聚合度6～8的壳寡糖的制备工艺。方法选用合适的酶降解壳聚糖,超滤、干燥;用TLC、HPLC、MALDI—TOF—MS检测产品。结果产品为白色,主要为聚合度6～8的壳寡糖。结论此工艺能用于制备聚合度主要为6～8的壳寡糖。     

由马铃薯淀粉制得磷酸寡糖的定性定量测定

对以马铃薯淀粉为原料、全酶法制得的磷酸寡糖进行定性定量分析。通过采用薄层层析法(thin layer chromatography,TLC)和高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(high-performance anionic exchange chromatography-air pulsing ampere detectors,HPAEC-PAD)对磷酸寡糖组分进行检测分析,同时利用红外吸收光谱(infrared spectroscopy,IR)对其进行结构分析。结果表明：磷酸寡糖是结合有磷酸基团的并且聚合度在3～7之间的麦芽低聚糖混合物,以麦芽三糖至麦芽六糖组分居多。     

毕赤酵母表达解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶及其水解制备可控结构壳寡糖

优化并全合成解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）壳聚糖酶编码基因并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现分泌表达,表达产物的蛋白质量浓度达到0.23 mg/mL。壳聚糖水解酶的最适pH值为5.0,最适温度为45 ℃,比活力达52.2 U/mL。该酶在50 ℃以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物进行了组成及结构分析。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度3～15、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振鉴定结果显示,壳寡糖组分的还原末端及非还原末端均主要由氨基葡萄糖组成。综上,本研究高效表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的壳聚糖酶,并制备了确定末端结构的壳寡糖,为壳寡糖的结构与功能关系研究提供理论支持。     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法测定大蒜寡糖和多糖分子质量分布

研究大蒜多糖的分子质量分布,探索获得适宜于结构研究的不同分子质量分布的大蒜多糖样品的方法。利用不同体积量的丙酮和乙醇为沉淀剂,得到一系列不同分子质量的大蒜多糖样品,并利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法测定各样品的分子质量分布。结果表明,不同体积量的丙酮与乙醇分解沉淀所获得的样品中都含有低聚糖和多糖,糖的分子质量分布在362～2811u 之间;丙酮对大蒜多糖的沉淀能力比乙醇好,3 倍体积丙酮的多糖提取液所获得样品中低聚糖的含量高于4 倍体积的乙醇。因此,通过调整丙酮或乙醇的的比例可得到不同分子质量分布的大蒜寡糖、多糖。     

即食食品中阪崎克罗诺杆菌的分离鉴定及分子分型

为了解即食食品中污染阪崎克罗诺杆菌的流行情况,分析我国阪崎克罗诺杆菌主要流行菌株,对即食食品中分离的10株阪崎克罗诺杆菌进行基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、VITEK 2、16s rDNA鉴定,采用多位点序列分型(MLST)方法对分离菌株进行分型,并对PubMLST数据库中322株中国分...     

魔芋寡糖的膜分离及产物组成分析

本文采用高速离心、无机陶瓷微孔滤膜、超滤纳滤对250 g/L(w/v)的高浓度魔芋精粉的酶解液进行分离、过滤、浓缩、制备魔芋寡糖,分析了甘露聚糖酶水解催化高浓度魔芋粉形成的具有一定粘性的寡糖溶液,对过滤通量、寡糖的回收率和寡糖产物组成的影响。结果表明,150 g/L的寡糖混合物通过超滤膜过滤,寡糖回收率能达到86%以上;组合纳滤膜能使寡糖混合物进行有效浓缩,可以去除溶液中的金属离子、有机酸小分子和溶剂水,提高寡糖溶质纯度。100~5000 Da的魔芋寡糖混合物通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)分析发现,寡糖的构成比例中三糖为最高单一组分,含量为21.5%,二糖~十四糖的总含量达到90%,十五糖-二十糖的含量为9%。因此,采用膜过滤技术用于魔芋寡糖分离、提纯和浓缩工艺是可行的。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱定性分析啤酒中糖类条件的优化

通过选择不同基质(2,5-二羟基苯甲酸、super DHB、2,4,6-三羟基苯乙酮)和设置不同啤酒样品稀释倍数(从原液到1 000倍稀释),优化了MALDI TOF MS定性分析啤酒中糖类的试验条件。研究结果显示,3种基质中,2,4,6-三羟基苯乙酮应用于MALDI TOF MS对啤酒中糖类表征的能力优于另外两种基质。当以2,4,6-三羟基苯乙酮为基质,啤酒样品稀释10倍时,MALDI TOF MS可达良好的定性分析效果。     

芒果多糖的纯化与光谱分析

采用热水浸提、乙醇沉淀法得到芒果多糖粗品;采用苯酚-硫酸法测其多糖含量为(46.3±1.75)mg/g。DEAE-25纤维素和Sephadex G-75凝胶层析柱进一步分离纯化得到白色絮状多糖;高效阴离子交换色谱法分析其单糖组成。结果表明：该多糖是由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖等单糖组成,其含量分别为(6.3±1.40)、(11.9±1.76)mg/g和(13.8±1.52)mg/g。红外光谱分析表明具有明显的多糖特征吸收峰,该多糖结构主要为β-糖苷键连接的吡喃型葡聚糖。     

低聚合度壳寡糖制备及其组分的色谱行为分析

利用壳聚糖酶水解壳聚糖,再通过乙醇沉淀法制备低聚合度（Dp<6）的壳寡糖。利用ShodexNH2P-504E色谱柱,以乙腈-氨水为流动相梯度洗脱,建立了一种分离度好、灵敏度高的壳寡糖HPLC分析方法;利用UPLC-MS定性鉴定壳寡糖中N-乙酰化的组分。研究还探讨了壳寡糖组分的色谱行为,发现壳寡糖的N-乙酰化是导致壳寡糖不按照聚合度大小进行色谱分离的主要原因,为壳寡糖质量分析、组分分离提供了依据。      

蒸汽爆破强度对玉米芯酶水解制备低聚木糖的影响

以玉米芯为底物,采用蒸汽爆破预处理与内切木聚糖酶定向酶水解相结合制取低聚木糖。基于高效阴离子交换色谱法对聚合度为2～6的低聚木糖组分的准确定量分析,研究蒸汽爆破预处理反应强度系数及其主要参数(反应温度和维压时间)对玉米芯定向酶水解制取低聚木糖的组成分布及产品得率的影响规律,确立最佳蒸汽爆破预处理条件。蒸汽爆破-定向酶解效果综合评价的结果表明,玉米芯最佳的蒸汽爆破预处理条件是反应强度系数3.76、反应温度200℃、维压时间390s。此时低聚木糖得率可达到最高值20.8%,且主要组分以木三糖、木四糖和木二糖为主,含量分别占总得率的43.5%、21.3%和18.6%。     

高粱原花青素的ESI-MS分析及其低聚体的RP-HPLC-MS/MS法分离鉴定

以高粱加工后的副产物--高粱外种皮为原料,采用电子喷雾离子化质谱(electrospray ionization-mass spectroscopy,ESI-MS)对ADS-17大孔树脂纯化的高纯度高粱原花青素(sorghum procyanidins,SPC)的组成进行分析,并通过反相高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)-质谱(RP-HPLC-MS/MS)联用对Toyopearl HW-40凝胶色谱分离的SPC-5级分进行分离鉴定。结果显示：SPC为低聚体原花青素,包含有儿茶素/表儿茶素单体、原花青素二～六聚体;SPC-5由8种三聚体和1种二聚体组成。     

枯草芽孢杆菌木聚糖酶的克隆表达及其酶解两种木聚糖的产物分析

通过基因克隆方法获得枯草芽孢杆菌木聚糖酶XynA,考察经镍离子亲和柱纯化后的XynA分别在桦木木聚糖和毛榉木木聚糖中的酶解情况,利用薄层色谱法（thin layer chromatography,TLC）及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/MS）法鉴定木聚糖酶XynA的酶解产物。运用MALDI-TOF/MS分析枯草芽孢杆菌木聚糖酶XynA酶解桦木木聚糖和毛榉木木聚糖产物不同的聚合度寡糖的分布情况。结果表明：在桦木木聚糖酶解液中,产生的中性木寡糖主要为木二糖（X2）和木三糖（X3）,酸性木寡糖聚合度为4～12,并且每一个酸性木寡糖上仅连接着一个甲基葡萄糖醛酸侧链（MeG）。在毛榉木木聚糖酶解液中,产生的中性木寡糖与在桦木木聚糖酶解液中相同,酸性木寡糖的结构相似,聚合度为4～16。因此木聚糖酶XynA具有生产木二糖（X2）和木三糖（X3）以及酸性木寡糖（MeGXn）的功能。     

散装食品中致病菌与卫生细菌指标检测技术研究

本研究旨在利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）快速检测并鉴定散装即食食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌。通过对点样方式、前处理方式、不同培养基及培养时间等各项实验条件的优化筛选确定最佳方法,并考察其检测限和稳定性,同时用所建立的方法与多重PCR法、VITEK 2等生化鉴定法进行结果比对,比较三者鉴定结果的一致性,最后进行批量食品样本检测来探寻MALDI-TOF MS鉴定法在散装即食食品中的适用性。结果表明,三种目标菌同一批次及不同传代次数的鉴定得分均大于95%,变异系数均小于2%,所建立的方法重复性和稳定性良好,且检测限为10⁵ CFU/mL,MALDI-TOF MS菌株鉴定结果与多重PCR法、生化鉴定法结果高度一致,且比二者检测用时更短,更加特异高效;在点样方式上,相较于夹心法与混合干滴法,三种覆盖法点样平均鉴定得分更高,均为99.9%,其中1 µL+1 µL覆盖法点样可获得的平均峰数目更多,特征峰更复杂且强度更高;而在前处理方式上,甲酸乙腈法与其他两种菌体处理方法相比可获得更多的出峰量和更高的峰强度,平均鉴定得分均在98%以上,且与数据库中图谱匹配度更高。综上所述,MALDI-TOF MS法在致病菌鉴定方面不仅灵敏特异、准确快速,且操作简便、结果直观,作为国标法的有力补充,为食源性致病菌的分析鉴定与分型溯源提供了新思路。

     

基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法对铜绿假单胞菌的鉴定与聚类分析

目的 建立基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption lonization-time of flight mass spectrometery, MALDI-TOF MS)快速鉴定和聚类分析铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)。方法 将全自动微生物分析仪鉴定为P. aeruginosa的20株分离株和1株标准菌株(CICC 21636)进行MALDI-TOF MS检测。经离线微生物鉴定软件分析, 所有菌株均报告为P. aeruginosa。获取21株 P. aeruginosa的特征蛋白质指纹图谱, 建立命名为Pseudomonas aeruginosa的自建数据库, 并采用 P. aeruginosa标准菌株CICC 21636进行验证。结果 Pseudomonas aeruginosa自建数据库对P. aeruginosa的鉴定结果较设备自带数据库明显提高。而且自建数据库信息基础上, 进一步对21株P. aeruginosa进行聚类分型, 实现了对不同来源P. aeruginosa可能污染源的追溯。结论 作为一种快速、准确、高通量的全新技术手段, MALDI-TOF MS能够实现对P. aeruginosa的特异性快速鉴定, 能满足在公共安全卫生、突发食品安全事件和口岸快速通关方面对P. aeruginosa的快速鉴定需求。     

Short communication: Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

Subclinical mastitis is a common and easily disseminated disease in dairy herds. Its routine diagnosis via bacterial culture and biochemical identification is a difficult and time-consuming process. In this work, we show that matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) allows bacterial identification with high confidence and speed (1 d for bacterial growth and analysis). With the use of MALDI-TOF MS, 33 bacterial culture isolates from milk of different dairy cows from several farms were analyzed, and the results were compared with those obtained by classical biochemical methods. This proof-of-concept case demonstrates the reliability of MALDI-TOF MS bacterial identification, and its increased selectivity as illustrated by the additional identification of coagulase-negative Staphylococcus species and mixed bacterial cultures. Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry considerably accelerates the diagnosis of mastitis pathogens, especially in cases of subclinical mastitis. More immediate and efficient animal management strategies for mastitis and milk quality control in the dairy industry can therefore be applied.     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法检测副溶血性弧菌

目的 建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)检测副溶血性弧菌的方法。方法 从样品预处理方法、分析菌量、培养基、培养时间方面分析各因素对MALDI-TOF-MS方法重复性、鉴定结果准确性的影响。将从市售420份水产品中分离并用全自动微生物鉴定及药敏分析系统生化鉴定为副溶血性弧菌的123株菌株,用MALDI-TOF-MS对其进行鉴定,对比2种方法的鉴定结果。结果 采用混合溶液法进行预处理,3%NaCl营养琼脂培养基, 36℃培养24 h,分析菌量为8 mg,用MALDI-TOF-MS进行分析所得到的特征峰多、峰型稳定、杂峰少,质谱图的准确性和重复性高、与生化鉴定匹配性好。分离得到的123株副溶血性弧菌鉴定分值大于2.000的达98.4%。结论 MALDI-TOF-MS作为一种快速、准确、高效的检测方法,可用于食品中副溶血性弧菌快速检测。     

对位芳纶纤维及其打浆粉末端基结构的MALDI-TOF MS分析

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对两种对位芳纶短切纤维(A1-PPTA、A2-PPTA)及其打浆粉末的端基结构进行分析,通过谱图特征峰与端基结构的对应关系,分析端基结构与反应机理的关联性及打浆过程产生粉末的原因。结果显示,A1-PPTA和A2-PPTA的聚合过程均采用了近似等摩尔的反应物来控制聚合过程;A2-PPTA的聚合过程发生溶剂链转移的几率更高;A2-PPTA中存在较多不利于纤维强度的端基结构,导致其打浆过程中产生更多粉末。