哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

哈茨木霉cDNA文库构建及表达序列标签分析

为了从分子水平上研究哈茨木霉的生物防治作用机制,构建了哈茨木霉菌丝体时期的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行了测序分析.所构建的文库滴度为1.2×106pfu/m l,重组率为93%,插入片断平均长度>1.2 kb.对随机挑选的305条ESTs测序分析,其中67条EST为已知基因,58条为已知EST,其余的180条为新EST.在已知基因中,有9条ESTs与生物防治相关.从对文库的初步检验结果看,文库具有良好的质量,符合大规模测序的标准.通过ESTs研究是获得功能基因的有效手段.     

绿色木霉内切葡聚糖酶基因Ⅰ的克隆表达

为深入研究绿色木霉(Trichoderma viride)内切葡聚糖酶(EGⅠ)的特性与功能,利用Northern blot方法分析不同碳源条件下绿色木霉的egⅠ表达,采用RT-PCR方法从绿色木霉T4中克隆egⅠ基因的cD-NA序列,测序与生物信息学分析,并构建诱导型表达载体pYES2-egⅠ,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1和H158中表达.结果表明:绿色木霉在含有纤维素的液体培养基中生长,egⅠ高效表达,在秸秆中表达量最高.纤维二糖中表达量相对较低,在葡萄糖、果糖中没有表达.egⅠ基因编码框长度1 377bp,编码459个氨基酸.含有信号肽,为分泌蛋白,属于糖苷水解酶家族7,具有纤维素酶结合域(CBD)和催化域(CD).INVSc1转化子发酵培养48 h达到转录高峰期,60 h达到酶活高峰期,酶活为0.081 6 U/mL,酶活比H158转化子提高32.5%.     

PEG-CaCl_2介导苏云金杆菌CryⅠA(b)基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,通过PEG-CaC l2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的CryⅠA(b)基因导入生防真菌哈茨木霉中.转化频率约为2~3个转化子/μg质粒DNA.Southern b lot和RT-PCR检测结果表明,CryⅠA(b)基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中,并且在转录水平上得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明,转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性,而且表现出了一定的杀虫效果.转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75.00%和72.73%.杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的途径.     

PEG-CaCl2介导苏云金杆菌CryIA(b)基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,通过PEG-CaCl2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的Cry Ⅰ A(b)基因导入生防真菌哈茨木霉中.转化频率约为2～3个转化子/μg质粒DNA.Southern blot和RT-PCR检测结果表明,CryⅠ A(b)基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中,并且在转录水平上得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明,转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性,而且表现出了一定的杀虫效果.转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75.00%和72.73%.杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的途径.     

PEG-CaCl2介导苏云金杆菌QyIA（b）基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株，通过PEG-CaCl2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的CryIA（b）基因导入生防真菌哈茨木霉中．转化频率约为2～3个转化子／雌质粒DNA.Southern blot和RT-PCR检测结果表明，CryIA（b）基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中，并且在转录水平上得到了表达．各转化子都能够稳定遗传．对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明，转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性，而且表现出了一定的杀虫效果．转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75．00％和72．75％．杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的诛径．     

HPV16 E6基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达HPV16 E6重组蛋白.利用自行构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6,经IPTG诱导表达HPV16 E6重组蛋白.实验结果表明,重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6在大肠杆菌中经IPTG诱导成功表达出HPV16 E6重组蛋白.HPV16E6重组蛋白的制备为宫颈组织中HPV16型感染的早期诊断和宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

大豆PM2蛋白11氨基酸结构域的耐盐功能鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3（late embryogenesis abundant group3）蛋白.以含大豆PM2基因的重组载体为模板,PCR法扩增出可编码6拷贝11-氨基酸重复序列的基因片段PM2D.构建pET28a/PM2D重组载体,并转化大肠杆菌得到重组菌BL21/PM2D.SDS-PAGE电泳结果表明,BL21/PM2D重组菌可被诱导表达相对分子质量约为15 000的蛋白条带,与目的蛋白的理论相对分子质量（13 600）接近.利用DNASIS软件分析,PM2D缺失短肽的亲水指数为1.12.将重组菌BL21/PM2和BL21/PM2D分别涂布在含500 mmol/L NaCl和1 200 mmol/L 山梨糖的固体培养基上,计算重组菌的存活率.结果显示,两种重组菌在含500 mmol/L NaCl培养基上的存活率分别为30.8%和26.0%,均高于对照菌（BL21/pET28a）的存活率;在含1 200 mmol/L山梨糖培养基上的存活率分别为59.7%和59.3%,与对照BL21/pET28a菌株的存活率相比无明显差异.PM2D短肽长度为PM2蛋白全长的1/4,但BL21/PM2D重组菌的耐盐能力为BL21/PM2重组菌的80%左右.表明11-氨基酸重复序列区是PM2蛋白序列的一个耐盐结构域.     

海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程的手段表达出具有活性的重组SjCL,为进一步研究组织蛋白酶L在海刺参自溶过程中的作用提供理论基础。