重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证

目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA)含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为(102.32±4.18)%、(102.77±4.94)%和(95.04±16.41)%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。     

铜绿假单胞菌外毒素A在生物制药中应用的研究进展

铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是该菌分泌的外毒素之一,通过催化细胞延伸因子2(elongation factor-2,EF-2)的ADP核糖基化,抑制蛋白合成,从而导致细胞死亡,在铜绿假单胞菌导致的感染性疾病中发挥重要作用。PEA强烈的细胞毒性特点使得该毒素成为免疫毒素的重要成分之一,已广泛应用于肿瘤的靶向治疗中。此外,由于PEA可与抗原提呈细胞表面的α₂巨球蛋白受体结合,通过胞饮作用进入胞内,辅助抗原的处理和提呈,可作为分子佐剂应用于各种疫苗的研发。本文对PEA在免疫毒素及疫苗佐剂方面应用的研究进展作一综述。     

铜绿假单胞菌外毒素A基因突变体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的将铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)基因突变为无毒性的ntPE基因,并在大肠埃希菌中进行表达。方法利用Primer Premier 5.0软件设计PEA基因引物及PEA基因第553位氨基酸缺失的突变引物,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)基因组DNA为模板,PCR扩增PEA基因,插入pGEM-T载体中,构建重组克隆质粒pGEM-PEA,以其为模板,利用突变引物,扩增ntPE基因(无毒性PEA),插入pET-30a载体中,构建原核表达质粒pET-ntPE,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析。结果测序结果证明已成功获得突变基因;原核表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约69 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%,可被小鼠抗PEA单克隆抗体特异性识别,具有较好的抗原性。结论已成功获得无毒性的PEA突变基因,为构建以PEA为蛋白佐剂的融合蛋白疫苗奠定了基础。     

铜绿假单胞菌次生代谢产物的研究进展

铜绿假单胞菌可产生多种具有活性的次生代谢产物。综述了铜绿假单胞菌次生代谢产物的种类、提取方法、合成方法、作用机制及用途,指出了研究中存在的问题,展望了未来的发展方向,拟为铜绿假单胞菌次生代谢产物的科学研究提供参考。     

高效液相色谱串联三重四级杆质谱法检测重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白质原液中氨苄西林残余量

目的建立高效液相色谱串联三重四级杆质谱法检测重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,r EPA)蛋白原液中氨苄西林残余量。方法用乙腈沉淀蛋白质,离心后收集上清,采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法上样分析,色谱条件:色谱柱Zorbax SB-C18 Rapid Resolution HT,1.8 Micron2.1 mm×100 mm,流动相30%乙腈,流速0.1 ml/min;质谱检测条件:多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM),正离子模式,ESI电压3 500 V,碎裂电压110 V,碰撞能10,气体流速8 L/min,母离子的质荷比(mass to charge ratio,m/z)=350.1,定量子离子m/z=105.8,定性子离子m/z=159.9。对建立的方法进行系统适用性、专属性、精密度、稳定性验证,确定该方法的线性范围及最低检出限、定量限,并进行基质效应试验。结果该方法试验参数符合检测要求,对氨苄西林的检测专属性强,当氨苄西林浓度在10~100 ng/ml范围内,r20.999 00,最低检出限为5 ng/ml,最低定量限为10 ng/ml。氨苄西林加标试验的回收率在98%~110%之间,重复性及日间精密度RSD均小于5.5%;冻融稳定性、样品前处理后的稳定性、短期稳定性试验中,样品回收率均在95%~120%之间;以超纯水5倍稀释的r EPA蛋白原液作为溶剂配制的3个不同浓度的氨苄西林对照品溶液的回收率均接近120%,RSD值在3%~5%之间,准确度和精密度良好。结论该方法系统适用性好,灵敏度高,专属性强,准确度和精密度好,检测时间短,是一种易于实现仪器自动化分析的方法。     

铜绿假单胞菌产抗菌代谢产物发酵条件的优化

以分离的铜绿假单胞菌作为实验菌株,以对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制效果及菌体干重为评价指标,采用单因素实验、正交实验优化铜绿假单胞菌产抗菌物质的培养基组分和发酵条件。结果表明:优化的培养基组分为黄豆粉2.5 g·L~(-1)、大豆蛋白胨10 g·L~(-1)、磷酸氢二钠10 g·L~(-1),优化的发酵条件为接种量2%、初始pH值7、发酵时间96 h。     

恶性疟原虫PfEMP1蛋白N-末端片段与铜绿假单胞菌去毒外毒素的偶联构建

目的将恶性疟原虫红细胞膜表面蛋白1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,Pf EMP1)N-末端区段(N-terminal segment,NTS)共价偶联到重组铜绿假单胞菌去毒外毒素(recombinant exoprotein A,r EPA)上,构建NTS-r EPA偶联蛋白,以提升NTS的免疫原性。方法用偶联试剂Sulfo-EMCS将马来酰亚胺基团加到r EPA上,利用NTS所携带的1个自由巯基将NTS共价连接到马来酰亚胺化的r EPA上,形成NTS-r EPA偶联蛋白,通过分子排阻层析从偶联反应产物中去除未偶联的蛋白。采用Ellman反应测定r EPA上所携带的马来酰亚胺基团数量以及NTS-r EPA偶联蛋白的偶联比,SDS-PAGE鉴定纯化的偶联蛋白。结果通过偶联试剂Sulfo-EMCS在每摩尔r EPA上加上了4.3摩尔的马来酰亚胺基团;NTS与马来酰亚胺化的r EPA反应生成了NTS-r EPA偶联蛋白,偶联比为4.1;通过分子排阻层析去除了未偶联的蛋白,得到了纯化的偶联蛋白。结论成功构建了NTS-r EPA偶联蛋白,为今后针对NTS的研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌RhlR抗血清制备

目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni~(2+)亲和层析纯化重组蛋白。将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价。结果构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85%,纯度大于90%。制备的RhlR抗血清效价可达1∶80 000。结论获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础。     

铜绿假单胞菌norB基因的克隆及表达

为使norB基因得到有效表达,利用分子生物学技术将铜绿假单胞菌B136-33的norB基因克隆至表达载体pET-28a上。首先,根据GenBank公布的norB基因序列及表达载体pET-28a上的多克隆位点进行引物(含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点)设计;然后以B136-33基因组为模板,扩增目的片段norB;产物经双酶切克隆至pET-28a后,化学转化至克隆菌DH5α,得到含有重组质粒的转化子DH5α-pET-28a-norB;再经双酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒pET-28a-norB转化至表达菌BL21;最后,用SDS-PAGE鉴定norB基因表达产物的分子量。结果表明,norB能在BL21中得到正确有效的表达。     

包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法的比较分析

近几年随着生活节奏的加快,包装饮用水的消费量逐年增高,但其中铜绿假单胞菌的检出率较高,且危害性较大,因此包装饮用水中的铜绿假单胞菌检测至关重要.本文基于现阶段实验室所采用的细菌检测手段,阐述了生化水平、基因序列、蛋白指纹图谱等6类铜绿假单胞菌的检测方法,旨在对铜绿假单胞菌的快速分离及准确鉴定提供参考,从而更好地保障饮水...     

CNTF工程菌培养及产物纯化

目的 建立ＣＮＩＦ生产工艺,获得高产量的ＣＮＴＦ活性蛋白质。方法 通过摇瓶和发酵罐培养研究 了培养基成分、ｐＨ、诱导时间对工程菌 ｐＢＶ２２０－ＣＮＴＦ／ＤＨ５Ａα生成和表达的影响,并对表达产物进行纯化和生物学活 性检测。结果 应用正交试验确定了培养基成分配比为酵母粉１０ｇ／Ｌ,葡萄糖８ｇ／Ｌ,ＭｇＳＯ４０．５ｇ／Ｌ,磷酸盐０．０５ｍｏｌ／Ｌ, ｐＨ７．４时最有利于工程菌的生长及ＣＮＩＴ的表达。ＣＮＴＴ纯化后纯度达９５％以上,并具有较高的生物学活性。结论 为ＣＮＴＦ的结构和功能的研究及临床应用打下基础。     

重组人干扰素α_(2b)工程菌的生物学特性检测

目的 观察和了解重组人干扰素α2b（以下简称rhIFN-α2b）工程菌的生物学性质,保证产品质量稳定。方法 通过对rhIFN-α2b工程菌的微生物学、分子生物学和免疫学检测,全面了解工程菌的性质。结果rhIFN-α2b工程菌呈现典型的大肠杆菌形态,在甘油中可以贮存1年,在冻干条件下可以保存2年,其生物学特性比较稳定。结论 rhIFN-α2b工程菌生物学特性稳定不变。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵及表达产物的纯化

目的 研究重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵和表达产物的纯化工艺。方法采用最适基质浓度、pH、溶氧量、培养温度等发酵表达条件及产物提纯方法。结果 菌体密度A6000达40.8,表达量达160mg/L。提纯的bFGF回收率为40％,生物学活性（ED50）为 0.21ng/mL,比活性达4.76×106U/mg,其纯度、分子量、残余DNA等各项检测结果均符合“重组 DNA制品质量控制要点”。结论 为hbFGF工业化生产和临床应用提供了依据。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

表达含凝血酶识别位点的rhGM-CSF融合蛋白工程菌的选定及其酶切后目的蛋白的纯化

比较 4株表达含凝血酶识别位点的rhGM CSF融合蛋白工程菌的特性 ,选定用于开发的工菌株 ,其表达产物相对分子质量为 2 6 0 0 0 ,N端 110 0 0为MS2 ,C端 15 0 0 0为rhGM CSF ,较易用凝血酶消化释放出目的蛋白。用阴离子交换、疏水和凝胶过滤层析 ,或后二者结合进行可得到适宜人体应用的纯品 ,活性达到 10 7IU mg蛋白。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10h。通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌58.0~71.8g/L,质粒含量可达到1.11~1.58mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

重组人G-CSF大肠杆菌表达产物的纯化及鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，并在大肠杆菌中高效表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体可溶性蛋白的25％以上。将其复性后，经CM52离子交换层析纯化，产物经SDS－PAGE分子量测定、肽谱分析、等电点测定表明与天然hG－CSF具有相同性质。免疫印迹证实rhG－CSF抗原特异性良好。用小鼠骨髓细胞集落形成法测定活性达1×108U／mg。     

Metabolomics Comparison of Drug-Resistant and Drug-Susceptible Pseudomonas aeruginosa Strain (Intra- and Extracellular Analysis)

Pseudomonas aeruginosa is a common human pathogen belonging to the ESKAPE group. The multidrug resistance of bacteria is a considerable problem in treating patients and may lead to increased morbidity and mortality rate. The natural resistance in these organisms is caused by the production of specific enzymes and biofilm formation, while acquired resistance is multifactorial. Precise recognition of potential antibiotic resistance on different molecular levels is essential. Metabolomics tools may aid in the observation of the flux of low molecular weight compounds in biochemical pathways yielding additional information about drug-resistant bacteria. In this study, the metabolisms of two P. aeruginosa strains were compared—antibiotic susceptible vs. resistant. Analysis was performed on both intra- and extracellular metabolites. The ¹H NMR method was used together with multivariate and univariate data analysis, additionally analysis of the metabolic pathways with the FELLA package was performed. The results revealed the differences in P. aeruginosa metabolism of drug-resistant and drug-susceptible strains and provided direct molecular information about P. aeruginosa response for different types of antibiotics. The most significant differences were found in the turnover of amino acids. This study can be a valuable source of information to complement research on drug resistance in P. aeruginosa.     

基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性

目的研究基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性。方法在有选择压力(加氨苄西林)的条件下,测定pYC2质粒在大肠杆菌BLG8900株[含有质粒pYC2的BL21(DE3)]中的遗传稳定性。结果工程菌连续传10、25、50和100代后质粒具有良好的稳定性,而且经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切,酶切图谱相同。第100代菌株重组质粒的GnRH/TRS序列与原代菌株相同。原代与第10、25、50和100代菌株经IPTG诱导表达,GST-GnRH/TRS融合蛋白表达水平、菌体蛋白的SDS-PAGE图谱鉴定无明显差异。Western blot表明各代菌株表达产物均具有GnRH抗原特异性。结论质粒pYC2在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中有较好的遗传稳定性。     

表达MAGE-1/HSP70/MAGE-3工程菌的稳定性

目的检测重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状的稳定性。方法将工程菌菌株连续传50代,每隔10代挑取单克隆菌落进行诱导表达,并计算质粒丢失率。提取不同代次的质粒,扫描电镜观察,检测融合蛋白表达水平,并进行工程菌的染色镜检及生化鉴定。结果pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)融合蛋白工程菌呈典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义。结论重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状稳定,可作为生产用菌种。