固定化β-葡萄糖苷酶转化糖苷型异黄酮的研究

利用固定化β-葡萄糖苷酶把糖苷型异黄酮水解成苷元型异黄酮,可以提高大豆异黄酮的生理活性.用海藻酸钙包埋富含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉孢子,可以方便有效地固定β-葡萄糖苷酶.研究考察了不同底物浓度,pH和温度对固定化β-葡萄糖苷酶酶解作用的影响,以及重复分批酶解条件下固定化酶的稳定性.当固定化酶珠体积占反应总体积的5%,糖苷型异黄酮浓度为1.2mg·mL-1,作用24 h,酶解效果良好.其中,大豆苷比染料木苷易于被酶解.固定化酶适宜的pH范围为3～5,最适pH值为4.8.耐热性比固定化前有所增加,在70℃以下酶较稳定.重复分批酶解糖苷型异黄酮,连续7批的转化率均可保持在90%以上.该研究结果在大豆异黄酮的生物转化方面具有潜在的应用前景.     

重组里氏木霉粗酶液提取虎杖中白藜芦醇的研究

为从虎杖中提取白藜芦醇并同步实现高效转化,经平板初筛和48 h的试管产酶复筛,从619株里氏木霉的基因重组菌中定向筛选出3株高产β-葡萄糖苷酶的菌株(BG-2,BG-4和BG-5)。摇瓶条件下产酶48h,三者的β-葡萄糖苷酶酶活为1.75,3.50和5.71 IU×m L~(-1),分别是出发菌株的36倍、73倍和119倍。以三者的发酵粗酶液直接处理虎杖粗提物,45℃条件下反应5 h后,与出发菌株相对比,重组菌株对白藜芦醇的提取率可达14.86~16.41 mg×g~(-1),是出发菌株的2.41~2.66倍;转化率可达120.5%~138.4%,是出发菌株的6.0~6.85倍,且反应液中基本无白藜芦醇苷残留。该研究策略从根本上提高了纤维素酶法对苷元型白藜芦醇的提取效率,可推广应用于其他易糖苷化的中草药成分的提取。     

微胶囊固定酶催化合成烷基糖苷的工艺优化

用微球截留固定化和酶催化有机合成技术对β-葡萄糖苷酶固定化及其催化合成烷基糖苷的工艺进行了研究.优化出酶同定化最优上艺为:壁材海藻酸钠4.0%、交联剂戊二醛0.2%、凝聚剂CaCl20.10 mol/L、酶用量140加mg.以固定酶为催化剂、葡萄糖和正丁醇为原料合成烷基糖苷,确定合成的最佳工艺为:正丁醇20 mL、糖醇比2.0:20(g/mL)、固定酶6 g、反应温度40℃,反应时间3 h.得到的固定酶活力比游离酶高,稳定性好,重复使用3次后仍有较好活性.     

嗜热β-葡萄糖苷酶的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化嗜热β-葡萄糖苷酶,并检测其活性。方法从嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans基因组DNA中PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因,插入原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)Codon Plus,筛选阳性重组菌,IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组酶;紫外吸收法检测酶活力和底物选择性。结果 PCR退火温度为67℃时,可扩增得到单一的目的基因条带;测序结果显示,重组表达质粒中目的基因的核苷酸序列与细菌基因组中该基因序列同源性为100%,未发现终止密码子及氨基酸的改变;表达的重组酶相对分子质量约为54 000;纯化的目的蛋白纯度达95%,浓度为10 mg/L;该重组酶能够高效催化对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p NPG)的水解,60℃条件下的比活力达124 293.5 U/mg。结论成功在E.coli中表达了嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans来源的具有较高催化活力和底物专一性的β-葡萄糖苷酶。     

沙棘叶黄酮糖苷生物转化黄酮苷元研究

沙棘叶中的黄酮类化合物主要以糖苷形式存在,现采用酶法水解糖苷中的糖基使其变成苷元,提高抗氧化活性.沙棘黄酮糖苷经过α-鼠李糖苷酶(1 IU)、β-葡萄糖苷酶(2 IU)、木聚糖酶(1.5 IU)、纤维素酶(15 IU)、果胶酶(0.5 IU)、α-淀粉酶(2 IU)组成的复合酶预处理后,黄酮糖苷转化率仅为0.23%,再用柚苷酶水解可获得高含量的黄酮苷元,转化率达85%以上,其中槲皮素占总黄酮苷元的23.31%,异鼠李素占35.11%,山奈酚占9.95%.沙棘黄酮苷元不易溶于水而溶于乙醇.     

嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因克隆表达与调控的研究进展

β-葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶,可水解纤维二糖生成两分子的葡萄糖。该酶在纤维素糖化水解过程中起关键性作用,是纤维素酶代谢途径中的限速酶。嗜热真菌因其极端的生长环境,是耐高温酶的主要来源,嗜热真菌来源的β-葡萄糖苷酶种类日益丰富。构建了含13种嗜热真菌β-葡萄糖苷酶的进化树,并对嗜热真菌中β-葡萄糖苷酶的来源、嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达、及已知的β-葡萄糖苷酶调控因子进行了综述。     

Eudragit L-100固定β-葡萄糖苷酶的性能研究

以Eudragit L-100(E)为载体,对β-葡萄糖苷酶(CB)进行固定化修饰,考察了各种因素对固定化酶活力收率的影响。并使用红外光谱、圆二色谱及荧光光谱对固定化产物进行表征。结果表明,酶的较佳固定化条件为pH=11.0,w(E)=1%,ρ(CB)=2mg/mL,固定时间60min,沉淀时间30min,固定化温度25℃,固定化酶活力收率为83%。固定化酶溶解度的变化条件为pH5.2时呈可溶性,pH4.5时呈不溶性。固定化酶的热稳定性有了一定的提高,并且固定化酶重复利用5次后仍保留41%的初始酶活力。     

7-羟基黄酮糖苷的合成研究

对传统的合成黄酮糖苷的方法进行了改进,以溴代乙酰糖和7-羟基黄酮为原料,四丁基溴化铵为相转移催化剂.以K2C03为除酸剂,采用固-液相转移催化法合成了7-羟基黄酮葡萄糖苷和7-羟基黄酮阿拉伯糖苷.另外,还研究了反应方式、温度、糖的种类等因素对收率的影响.     

β-葡萄糖苷酶促香荚兰快速生香工艺的研究

用β-葡萄糖苷酶处理香荚兰豆荚,并以HPLC法分析所得到豆荚中香兰素等4个糖苷水解成分的含量变化情况。结果表明,采用外加β-葡萄糖苷酶酶促生香工艺可以促进香荚兰青荚中糖苷化合物分解完全,提高豆荚中香兰素的含量,缩短生香陈化时间,具有潜在的生产应用价值。     

一种新型内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

刺糙青霉(Penicillium echinulatum)可产生一种耐热、耐碱的新型内切-β-葡聚糖酶(EGL1),具有重要的工业应用价值。鉴于野生型刺糙青霉的产酶水平低,将该菌的内切-β-葡聚糖酶基因经过密码子优化后,在里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行重组与表达,采用里氏木霉强启动子Pcbh1(纤维二糖水解酶Ⅰ)及其信号肽,以pCAMBIA1300为载体骨架构建重组质粒pCB-PET,并采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒pCB-PET导入里氏木霉的分生孢子中,在潮霉素抗性平板上筛选获得5个优良的重组转化子。将5个转化子重复传代培养10个批次后,分别提取染色体DNA进行PCR验证,均可检测到目的基因Egl1n(密码子优化后的Egl1)条带,说明该基因已稳定地整合到里氏木霉基因组中。采用SDS-PAGE蛋白电泳对转化子培养液进行检测,获得了与目的基因表达产物相符的蛋白条带(约41 kDa),表明Egl1n已在重组里氏木霉中成功实现了胞外表达。重组转化子在30℃,摇瓶转速200 r×min~(-1)条件下培养48 h,取发酵上清液在pH 8.0,60℃条件下,测得内切-β-葡聚糖酶活力为382.6 U×mL~(-1),是出发菌株的22.5倍。酶学性质研究结果表明:该酶耐热性能较好,在70℃以下性能稳定,其最适催化温度为60℃;该酶在pH 5.0~10.5稳定性较好、具有明显的催化活性,其最适pH为8.0,属于碱性纤维素酶。从而成功地实现了刺糙青霉内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与胞外表达,有关研究结果在里氏木霉纤维素酶的定向进化及其工业化应用中具有重要的促进作用。     

- 葡萄糖苷酶的研究

研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的影响及β-葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉β-葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以 40 g/L 麸皮为碳源,在 250 mL 三角瓶中装液 40 mL,接种量 8%,初始pH值5.5, 30℃、 170 r/min 下培养 10 d,β-葡萄糖苷酶活力为 19.12 IU/mL。β-葡萄糖苷酶最适温度为 65℃,40℃ 时稳定性较好;最适pH值为4.8,在pH值3.0～5.0之间稳定性较好。     

静电纺丝制备苯乙烯马来酸酐共聚物纳米纤维及其固定化β-D-半乳糖苷酶

采用静电纺丝技术制备苯乙烯-马来酸酐共聚物纳米纤维,最佳电纺条件为:聚合物浓度0.35g/mL、针尖到接收板距离25cm、电纺液流量250μL/h、电压21kV.该条件下获得了直径约300nm且分布均一的纳米纤维.利用该纳米纤维固定β-D-半乳糖苷酶,固定化反应的最适pH值为4.0,此时酶负载量为(15.1±0.5)mg/g.固定化酶催化2-硝基苯酚-β-D-半乳吡喃糖苷水解反应的米氏常数K_m=2.7mmol/L,略大于游离酶的K_m值(2.2mmol/L);最大反应速率V_(max)为97.2μmol/(min·mg),为游离酶的47.8%.固定化酶在37℃下重复操作21次后活性损失仅为15%.在连续搅拌式反应器中将固定化酶用于催化乳糖的水解反应,连续使用17d仍能稳定运行.     

几种N—乙酰氨基葡萄糖苷的合成

N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶[E.C.3.2.1.30;NAGase]在临床上用作早期肾功能损伤的特征指标。检验 NAGase 的试剂主要有对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(PNP-NAG)、4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(4MU-NAG)、2-氯-4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(CNP-NAG)。文献报道的这些糖苷化合物的合成方法为:     

三相法从苦杏仁中分离制备β-葡萄糖苷酶

为了提高苦杏仁β-葡萄糖苷酶的纯化度和酶活回收率,采用三相法从苦杏仁粗酶提取液中制备β-葡萄糖苷酶。分别研究了有机溶剂种类及浓度、硫酸铵饱和度、p H和温度对三相分离过程的影响。结果表明:叔丁醇为最佳有机溶剂,粗提物与叔丁醇的体积比为1.0∶1.5,硫酸铵饱和度为50%,体系p H=5.0,最佳温度为25℃。在该优化条件下,苦杏仁β-葡萄糖苷酶的纯化倍数达到5.97,酶活回收率为85.7%。     

黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶过程中pH值的调控

研究了初始pH值对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的影响,并对产酶过程中pH值进行了人工调控.结果表明,利用黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的最佳初始pH值为5.0;使用氢氧化钠稀溶液能有效地时产酶过程中的pH值进行调控;将产酶期的pH值控制在4.0左右时,有利于β-葡萄糖苷酶的分泌,发酵120 h,酶活力能达到6.12 U·mL-1,大大高于调控前的酶活力.对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶工艺的制定及提高β-葡萄糖苷酶的产率具有重要的指导作用.     

马尾松针叶酚类化合物研究

本文报道了马尾松(Pinus massoniana Lamb.)针叶的黄酮类,木脂素类和黄烷-3-醇类化合物组成。从针叶中共分离了三十一种多酚化合物,其中十种为作者芦次发现的新天然化合物。研究表明,马尾松针叶和其它松针叶类似,主要亲水性多酚化合物为黄酮和木脂素的苷类化合物,并有C-甲基黄酮醇和酰化黄酮苷类化合物。本研究中分离鉴定的双氢槲皮素3′-0-β-D-(6″0-苯乙酰基)-葡萄糖苷是自然界中首次发现的由苯乙酸酰化的黄酮苷。据我们所知在其它苷类化合物中也未发现过类似酰化糖苷。     

超声辅助酶法提取茶麸黄酮及其对Ⅱ型5α-还原酶抑制活性

通过正交试验优化超声辅助酶法提取茶麸黄酮的工艺条件，同时建立了Ⅱ型5α-还原酶体外酶促反应体系考察茶麸提取物对Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性，并通过分子对接模型对茶麸中主要黄酮组分抑制Ⅱ型5α-还原酶的机理进行了模拟，为茶麸中黄酮类活性物开发和应用提供了基础。正交试验优化的提取工艺为：50℃下，50%乙醇，酶解p H=6，添加茶麸质量2.5%的纤维素酶酶解1 h，再以45 kHz,50℃超声提取30 min，此优化条件下总黄酮得率为（10.13±0.32）mg/g。通过超高效液相色谱质谱（UPLC Q-TOF MS）初步推断茶麸中主要含有山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷和山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷两种特征黄酮类化合物。茶麸总黄酮具有Ⅱ型5α-还原酶抑制活性，分子对接模拟结果显示山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷与5α-还原酶的结合能力与非那雄胺相近，可能是茶麸总黄酮中抑制Ⅱ型5α-还原酶的主要活性分子。     

α-淀粉酶在MCM-41介孔分子筛上的固定化研究

采用浸渍法将α-淀粉酶固定在介孔分子筛MCM-41上。考察了吸附时间、给酶量和pH对α-淀粉酶固定化性能的影响,并对固定化酶的活性、稳定性和载体结构等进行了研究。结果表明,在固定化时间为11 h,给酶量为70 mg.g-1,pH=5.9的条件下,固定化酶活性回收率可达48%。与游离酶相比,固定化酶的耐热能力增强,温度达到70℃时,固定化酶相对活性可达到75%,而游离酶只有14%;在pH=3.3～8.0的内,固定化酶相对活性为62%～100%,而游离酶的相对活性为5%～100%,固定化酶具有更宽的pH适应性;此外,固定化酶储存稳定性明显增强,并具有一定的可重复操作性,且固定后载体仍然保持了良好的介孔结构。     

一种转葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其生物催化合成α-熊果苷

通过一步法克隆试剂盒将来自野油菜黄单胞菌的转葡萄糖苷酶基因与表达载体pET28a同源重组,构建质粒pET28a-agl,并转化到不同感受态细胞中,筛选出高效表达转葡萄糖苷酶的基因工程菌E.coli BL21 Gold(DE3)plysS pET28a-agl,以催化合成α-熊果苷。利用IMAC亲和层析,获得转葡萄糖苷酶用于其酶学性质的研究。催化合成α-熊果苷的较佳反应条件为:转葡萄糖苷酶的质量浓度0.272 5 g/L,对苯二酚质量浓度11 g/L,麦芽糖浓度1.1 mol/L,磷酸盐缓冲液浓度100 mmol/L(pH=6.5),30℃下摇床反应3 h。研究发现,反应产物α-熊果苷对转葡萄糖苷酶反应有轻微的抑制作用;1 mmol/L K~+对转葡萄糖苷酶的相对酶活有提高作用,1 mmol/L Cu~(2+)几乎能完全抑制该酶活性。     

环氧树脂固定化卤醇脱卤酶的研究

采用环氧树脂ES-103B对卤醇脱卤酶进行固定化,对最优固定化条件及固定化酶的操作稳定性进行了研究。结果最佳固定化条件为:吸附温度为25℃,吸附缓冲液为p H 7.0磷酸钠缓冲液,初始酶质量浓度为0.5 mg/m L,共价时间为24 h。在此优化条件下,固定化酶的酶活回收率为74.5%,酶蛋白固定化效率为94.2%,比活力为518.6 U/g。利用固定化酶催化1,3-二氯丙醇制备环氧氯丙烷,重复使用15批次后,产物收率仍能保持在初始收率的91%以上,具有良好的工业化应用潜力。