花椒籽蛋白抗菌肽的分离纯化研究北大核心CSCD

分别用胃蛋白酶、酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制得两种粗酶液（A肽和B肽）,以抑菌率为指标,依次采用超滤、Sephadex G-50凝胶层析进行分子截留和分离纯化,用Tricine-SDS-PAGE电泳测定其主要抗菌肽的相对分子质量。结果显示：两种酶解产物的粗酶液经超滤后,获得的相对分子质量为5~10 k D的组分（A-b肽和B-b肽）对大肠杆菌的抑菌率最高,分别为62.79%和66.94%;将A-b肽和B-b肽进行凝胶层析,分别分离得4个组分,其中A-b肽活性最大的是组分G4（A-b-Ⅳ肽）,对大肠杆菌的抑菌率为100%,B-b肽活性最大的是组分F3（B-b-Ⅲ肽）,对大肠杆菌的抑菌率为69.99%;A-b-Ⅳ肽和B-b-Ⅲ肽的相对分子质量分别为8.11 k D和10.80 k D。     

猪股骨头胶原蛋白降血压肽的分离纯化

依次采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对猪股骨头胶原蛋白进行酶解,制备降血压肽。为了得到高活性、高纯度的降血压肽,依次采用超滤、离子交换层析、凝胶层析对酶解液进行分离纯化,采用体外检测方法测定各分离产物对血管紧张素转化酶活性的半抑制浓度（IC50值）。结果显示：猪骨酶解液经超滤分离获得分子质量小于5 ku的组分对血管紧张素转化酶的抑制活性最高,IC50值为1.400 2 mg/mL;该组分进行离子交换层析分离得4个组分,其中组分2的活性最高,IC50值为0.488 4 mg/mL;再将组分2进行凝胶层析分离得4 个组分,其中组分2-2的活性最高,IC50值为0.195 3 mg/mL。     

超滤对芸豆蛋白酶解物抗氧化活性的影响

采用超滤法从芸豆蛋白酶解物中初步分离纯化抗氧化活性肽。研究超滤系统主要参数对膜通量的影响,确定最优的超滤条件和膜清洗方法,并对超滤前后酶解物的相对分子质量分布、氨基酸组成及抗氧化活性进行比较。结果表明：采用改性聚醚砜平板超滤膜在室温,酶解液质量分数2.5%,pH6.5 和压力0.25MPa 条件下的分离纯化效果较好;超滤能有效去除酶解液中相对分子质量较大的组分,相对分子质量2000～1000D 及1000D 以下的组分分别从11.38% 和12.64% 提高到32.83% 和 45.91%,其抗氧化活性也得到明显提高。     

鲶鱼骨蛋白酶解物中抗菌活性物质的初步分离纯化

用胃蛋白酶酶解鲶鱼头、鱼骨,酶解得到抑菌活性较高的鲶鱼骨酶解液,然后对酶解液进行初步分离与纯化。鲶鱼骨蛋白抑菌活性最强的酶解物经过超滤(MW3 000 u)和Sephadex G-15凝胶层析分离纯化,采用比浊法和滤纸片法测定其抑菌活性。结果表明,分离纯化后,酶解混合物对大肠杆菌、藤黄微球菌以及枯草杆菌的抑菌活性都有一定的提高,其中层析后峰2的抑菌活性最强,峰2对大肠杆菌、藤黄微球菌以及枯草杆菌的抑菌活性要比酶解粗品提高1倍左右,且各组分的平均分子质量均在1 500 u以下。峰2经反相高效液相色谱分析得出,组分由70多种物质组成,要想得到纯的抗菌活性物质还需要进一步深入研究。     

猪骨免疫活性肽的分离纯化

为了从猪骨中分离纯化出免疫活性肽,使用超滤、sephadex G-25凝胶层析、SP-sephadex C-25离子交换层析等手段对鲜猪骨的Alcalase碱性蛋白酶的酶解液进行分离纯化,采用MTT法测定各分离产物对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性。结果显示:猪骨酶解液经超滤分离获得的分子质量小于2 ku的组分对小鼠脾淋巴细胞增殖率最高;对分子质量小于2 ku的组分采用凝胶过滤层析,对层析后活性最高的组分再进行离子交换层析,最终得到的组分质量浓度为100μg/m L时,对小鼠脾淋巴细胞的增殖率为114.30%。     

螺旋藻抗氧化肽的制备及其体外活性研究

为了制备高活性的螺旋藻抗氧化肽,通过优化木瓜蛋白酶酶解条件,并结合超滤、凝胶过滤层析等方法,从钝顶螺旋藻酶解液中分离、纯化抗氧化肽,并对其体外抗氧化活性进行研究。结果表明,木瓜蛋白酶酶解钝顶螺旋藻的最适工艺条件为:酶底比1.6%、温度60℃、水解时间9 h、pH7.0。相对分子质量范围为0到3 000的螺旋藻酶解液的抗氧化活性最高。该部分酶解液通过凝胶层析纯化获得更高活性的螺旋藻抗氧化肽,其DPPH·清除率、OH·清除率和总抗氧化能力分别相当于质量浓度为(1.01±0.07)×10-2、(4.77±0.28)×10-1、(3.79±0.81)×10-2mg/mL的抗坏血酸溶液,从而为螺旋藻抗氧化肽用于抗氧化功能食品和生物制药方面奠定基础。     

牛骨胶原蛋白源抑菌肽的分离纯化及成分分析

牛骨胶原蛋白经中性蛋白酶水解,采用超滤技术和凝胶层析技术对酶解液进行分离纯化并测定对大肠杆菌的抑菌活性;借助反向高效液相色谱和基质辅助激光解析/离子化串联飞行时间质谱仪对抑菌肽进行分析.结果表明:经超滤分离后,分子质量小于10kD的组分对大肠杆菌的抑菌活性强;Sephadex G-25柱分离得到的峰Ⅰ和峰Ⅳ组分有较强的抑菌活性.经反向高效液相色谱和基质辅助激光解析/离子化串联飞行时间质谱仪分析,峰Ⅰ组分中含有的多肽种类多,分子质量集中在850～1550D之间.峰Ⅳ组分含有的多肽种类较少,分子质量集中在700～900D之间.     

蛋清抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

为了获得高活性、高纯度的蛋清抗氧化肽,以蛋清酶解物为原料,依次釆用超滤、离子交换色谱、凝胶色谱分离纯化抗氧化活性较强的肽段,运用基质辅助激光解吸离子化质谱解析肽链的氨基酸序列。结果表明:超滤法分离纯化EWPH所得的三个组分中,EWPH-Ⅲ(M_W<3 kDa)组分的DPPH自由基清除率最高,达到79.62%。离子交换层析分离纯化EWPH-III所得到的碱性组分B的DPPH自由基清除率最高,达到82.05%。凝胶过滤色谱分离EWPH-III-B所得到4组分中E组分的DPPH自由基清除率最高,为88.49%。高活性高纯度EWPH-III-B-E组分的相对分子质量为237.575,该二肽的氨基酸序列为丙氨酸-甲硫氨酸。     

亚麻籽降胆固醇活性肽的酶解工艺优化及分级制备

以亚麻籽分离蛋白为原料,利用酶解工艺制备降胆固醇活性肽。对蛋白酶进行了筛选,并通过单因素实验和正交实验确定最优酶解工艺,采用超滤分离技术得到具有较高降胆固醇活性的亚麻籽肽,并对超滤前后亚麻籽肽的氨基酸组成及降胆固醇活性进行了研究。结果表明:最佳酶解工艺条件为采用Protease M进行酶解、加酶量1. 5%、底物质量分数2. 0%、酶解温度50℃、酶解时间3 h,在此条件下亚麻籽肽的降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达53. 19%;超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分降胆固醇活性最强,胆固醇胶束溶解度抑制率达72. 39%,较超滤前提高了19. 20个百分点。氨基酸分析结果表明,超滤后相对分子质量小于1 kDa的多肽组分的总疏水性氨基酸含量明显高于超滤前,提高了15. 97个百分点,而且多肽组分中赖氨酸/精氨酸的比值低于超滤前,这可能是其降胆固醇活性强于超滤前的主要原因。     

离子交换层析法分离猪股骨降血压肽的研究

猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析初步分离后,为了得到高活性且纯度较高的降血压肽,采用离子交换层析对凝胶层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱液p H、离子强度、流速三个因素进行研究,确定了最佳分离条件:以p H=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液、B液为含1mol/LNa Cl的p H=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液,洗脱流速为0.8m L/min。结果显示:离子交换层析分离得3个组分,其中组分1的活性最高,其IC50值为0.1012mg/m L;再利用凝胶层析将组分1进行脱盐,其峰2的IC50值达到0.0836mg/m L,脱盐率达到86.60%±0.5%。     

Rhizopus chinensis 12#发酵产生纤溶酶的分离提纯

分离自南方小酒药的华根霉12#(Rhizopuschinensis12#)以豆粕和麸皮为原料固体发酵可产生多种纤溶活性组分.采用饱和度40%～70%的硫酸铵溶液分步盐析、OctylSepharoseFastFlow疏水层析、Q SepharoseHighPerformance离子交换层析和SephacrylS 100凝胶层析方法对活性组分进行分离提纯,得到电泳纯的纤溶酶.SDS PAGE方法测定该酶相对分子质量为18000,凝胶过滤方法测定相对分子质量为16600,表明该酶由单亚基组成.     

酪蛋白源ACE抑制肽的分离纯化

采用碱性蛋白酶酶解酪蛋白制备ACE抑制肽.通过正交实验得到最佳酶解条件为:温度50℃,pH值7.5,酶用量5%,底物质量分数5%,在此条件下,ACE抑制活性为47.23%.采用超滤对酶解液进行初步分离,得到分子量小于4 ku的组分,其ACE抑制活性为57.34%.用凝胶柱SephadexG一25进行进一步纯化,纯化后的组分ACE抑制活性最高可达62.78%,比原酶解物的ACE抑制活性高了24.77%,其相对分子质量在1 500 u以下.     

干酪乳清酶解产物抗氧化肽的分离和纯化

干酪乳清Alcalase 2.4L酶解的最优条件,即酶解时间为2 h、pH 9.5、酶与底物比为4%、酶解温度为50 ℃。利用超滤、葡聚糖凝胶层析和三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（tricine-sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,tricine SDS-PAGE）等方法从干酪乳清中提取抗氧化性蛋白肽。分别考察操作压力、料液温度、料液pH值、操作时间对超滤膜膜通量的影响。乳清酶解物超滤的最佳条件为：压力0.25 MPa、温度30 ℃、时间120 min、初始pH 9.0。分子质量4 000～6 000 D肽的水解液脂质过氧化抑制率最高,达到47.28%。利用Sephadex G-50型葡聚糖凝胶进行纯化,将分离的组分进行Tricine-SDS-PAGE分析和脂质过氧化抑制率的测定。第34管洗脱液的脂质过氧化抑制率最高,分子质量范围为4 000～4 100 D。     

草鱼蛋白源抗氧化肽的分离及鉴定

利用超滤、离子交换色谱、高效逆流色谱以及凝胶过滤色谱等系列分离纯化技术从草鱼蛋白酶解产物中分离纯化抗氧化活性肽,分离过程中发现相对分子质量1～3kD 的组分抗氧化活性最强,且碱性肽组分的抗氧化活性强于酸性或中性肽组分、疏水性肽组分的抗氧化活性强于亲水性肽组分。最终借助反相高效液相色谱在线连接的电喷雾质谱结合氨基酸分析鉴定出一种抗氧化肽,一级结构序列为Pro-Ser-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Val,相对分子质量为966.3D。     

坛紫菜降血压活性肽的分离纯化及分子质量测定

用AS.1398 中性蛋白酶酶解制备坛紫菜(Porphyra haitanesis)ACE 抑制肽,并经超滤膜、Sephadex G-15 凝胶层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化,纯化产物测定其氨基酸组成,并运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子质量。结果显示：坛紫菜酶解液经超滤分离获得分子质量小于2000D 的组分ACE 抑制活性最高,IC50 为0.73mg/mL;该组分进行Sephadex G-15 凝胶层析分离得6 个组分,组分E 的IC50 最小,为0.67mg/mL。组分E 经RP-HPLC 分离得峰6 对ACE 的抑制率最高,达到89.54%;峰6 再次过RP-HPLC,又洗出2 个蛋白峰,说明峰6 并不是单一物质,还需进行多次反复纯化。测定峰6 的氨基酸组成主要含有Tyr、Val 和Phe,同时采用MALDI-TOF-MS 分析发现有8 个主要的质子峰,信号最强的质子峰为m/z 861.17,有4 个峰聚集在m/z 860 左右,说明峰6 平均分子质量大约为860D,推算出紫菜降血压肽含有3 个Val、2 个Phe、1 个Tyr,N 端为Val,可能的排序顺序有18 种。     

脱盐、超滤处理卵白蛋白源ACE抑制肽及其理化性质的研究

卵白蛋白是蛋清中的主要蛋白质,利用卵白蛋白制备ACE抑制肽可为其高值利用提供参考。本文采用离子交换色谱对卵白蛋白的粗酶解物进行脱盐处理,确定了室温25℃、20 m L进样量、8 BV/h的脱盐工艺条件。在上述条件下,酶解物脱盐率达到83.6%,氮回收率和ACE(血管紧张素转换酶)抑制率分别为87.71%和80.31%。再采用截留分子量为10 ku和3 ku的两种超滤膜将脱盐酶解物分离成10 ku、3~10 ku和3 ku三个组分,最佳操作条件:超滤时间40 min、操作压力1.5 bar、温度35℃(10 ku)和30℃(3 ku)。超滤所得三个组分均具有ACE抑制活性,其中分子量3 ku的超滤物活性最高,该组分与粗酶解物相比较,总巯基和表面巯基含量显著降低(p0.05),同时表面疏水性显著提高(p0.05),热稳定性增加。因此,卵白蛋白的粗酶解物经脱盐、超滤处理,可以明显去除其中的盐分,并得到ACE抑制活性较高的分离组分。     

螺旋藻抗氧化肽的制备及其体外活性研究

为了制备高活性的螺旋藻抗氧化肽,通过优化木瓜蛋白酶酶解条件,并结合超滤、凝胶过滤层析等方法,从钝顶螺旋藻酶解液中分离、纯化抗氧化肽,并对其体外抗氧化活性进行研究。结果表明,木瓜蛋白酶酶解钝顶螺旋藻的最适工艺条件为:酶底比1.6%、温度60℃、水解时间9 h、pH7.0。相对分子质量范围为0到3 000的螺旋藻酶解液的抗氧化活性最高。该部分酶解液通过凝胶层析纯化获得更高活性的螺旋藻抗氧化肽,其DPPH·清除率、OH·清除率和总抗氧化能力分别相当于质量浓度为(1.01±0.07)×10-2、(4.77±0.28)×10-1、(3.79±0.81)×10-2mg/mL的抗坏血酸溶液,从而为螺旋藻抗氧化肽用于抗氧化功能食品和生物制药方面奠定基础。     

大豆肽的超滤分离及其清除自由基活性研究

采用不同截留相对分子质量的超滤膜进行超滤分离大豆分离蛋白酶解液,研究超滤过程中操作压力、料液质量浓度、超滤时间对超滤膜通量的影响,确定最佳超滤条件,并测定各超滤级分清除·OH与DPPH·的能力。结果表明:在操作压力0.2 MPa、料液质量浓度50 g/L、通过相对分子质量为10、3、1 k D超滤膜的操作时间80 min、通过相对分子质量为5 k D的超滤膜的操作时间100min的超滤条件下分离大豆肽,超滤效果较好;相对分子质量小于3 k D的小分子大豆肽具有较高的自由基清除率,且对于·OH与DPPH·的清除率具有较高的一致性。     

泥鳅肉酶解物对羟自由基的清除作用

为了探讨深度开发泥鳅蛋白制备功能性肽的可能性,采用比色法研究泥鳅肉酶解物对Fenton 体系产生的羟自由基的清除效果,从复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶5 种酶中,筛选出菠萝蛋白酶作为酶解泥鳅肉制备具有清除羟自由基活性酶解物的适宜水解酶。用响应面分析法(RSM)对该酶的酶解条件进行优化,并采用Sephadex G-15 凝胶层析测定最佳酶解条件下制得的酶解液中活性肽的相对分子质量分布。结果表明,菠萝蛋白酶的最佳酶解条件为：固液比1:4、加酶量0.2%、pH6.47、温度54.48℃、酶解时间59.97min,酶解物对羟自由基的清除率为99.03 %,IC50 值为0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相对分子质量范围为1129～2344。     

红松仁清蛋白ACE抑制肽的分离纯化与结构鉴定

为研究酶解红松仁清蛋白中具有血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性短肽的组分及其序列,采用超滤、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色谱对松仁清蛋白酶解液进行分离纯化,对纯化后样品(组分D2)进行质谱结构鉴定。质谱结果进行从头测序,筛选得到ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys(YLLK),分子质量为535.34 D。该肽经固相合成纯度为99.80%,其半数抑制浓度测定值为0.282 5 μmol/L。